Audiologic Study in Guinea Pig after Administration of PAI-1

Kim, Beom Gyu; Park, Il Seok; Kim, Yong Bok; Kang, Hun Hee; Jung, Jong Woo; Jeon, Sea Young

Original Article

Anatomy and physiology

Korean Journal of Audiology 2006;10(2):135-140.

Audiologic Study in Guinea Pig after Administration of PAI-1

Beom Gyu Kim¹, Il Seok Park¹, Yong Bok Kim¹, Hun Hee Kang², Jong Woo Jung², Sea Young Jeon³

¹Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul
²Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan, College of Medicine, Seoul
³Department of Otolaryngology, College of Medicine, Gyeongsang National U

기니픽에서 PAI-1 투여후 청각학적 고찰

김범규^¹^, 박일석^¹^, 김용복^¹^, 강훈희^²^, 정종우^²^, 전시영^³

^¹한림대학교 의과대학 이비인후과학교실
^²울산대학교 의과대학 이비인후과학교실
^³경상대학교 의과대학 이비인후과학교실

Abstract

Plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) is an important regulator in the degradation of extracelluar matrix and fibrinolysis which inhibits thrombolysis in the vascular system. PAI-1 is normally secreted by endothelial cells, vascular smooth muscle cells, hepatocytes, platelets and adipocytes, with the majority of the circulating PAI-1 contributed to by adipose tissue. In type II DM, coronary artery diseases and peripheral vascular diseases, however, many studies report that plasma PAI-1 levels are elevated. In this study, we investigated the physiologic changes of cochlea after administration of PAI-1 in guinea pigs to find out the effect of PAI-1 on the microcirculation of cochlea. Guinea pigs with normal Preyer's reflex were divided into a control group and treatment groups receiving 10, 20, 40 μg/ml of PAI-1. Using auditory brainstem response (ABR), the hearing threshold was measured during the four weeks after placement of saline and PAI-1 on the round window membrane (RWM). Endocochlear potential (EP) was checked through endolymphatic space at the 2nd turn of cochlea. The ABR threshold was increased from mild to moderate at 30 minutes for the majority of the groups, but they began to recover at 1-3 days (p<0.05). The hearing threshold was not proportional to it's concentration. EP was significantly decreased in most PAI-1 groups in contrast to the control group (p<0.05). From these results, we can conclude that PAI-1 plays a role in the alteration of microcirculation of cochlea, and that it leads to transient hearing loss. Our studies suggest that PAI-1 is involved in part in the mechanism of inner ear disease that results from the disturbance of microcirculation.

Keywords: Plasminogen activator inhibitor-1;Hearing threshold.

교신저자：김범규, 150-719 서울 영등포구 영등포동 7가 94-200
교신저자：전화) (02) 2639-5480, 전송) (02) 2637-5480, E-mail：kbgyu@hallym.or.kr

서 론

내이의 항상성(homeostasis)유지에 영향을 주는 요인들 중에서 와우 혈류량의 변화는 중요한 인자로서 다양한 내이 질환의 원인으로 알려져 있다. 최근 당뇨병에서 증가된 심혈관계 질환의 위험도를 설명하고, 각종 말초혈관질환들의 기전을 밝혀내기 위해 혈액응고의 과형성과 섬유소분해능의 감소 등에 대해 많은 연구와 보고가 되어지고 있다.¹⁾²⁾³⁾
Plasminogen activator inhibitor type 1(PAI-1)은 약 50-kD의 단일 사슬 구조로 된 당단백으로 그 유전자는 12.2 kb로 7번 염색체에 위치하며, serine protease inhibitor superfamily에 속한다. 세포기질단백의 분해와 섬유소 용해 과정에 중요한 plasminogen/plasmin system의 가장 주된 조절인자로서 혈관계에서 혈전용해에 주로 관여하는 tissue plasminogen activator(tPA)와 종양세포의 침윤에 주로 관여하는 urokinase plasminogen activator(uPA)와 1：1로 빠르게 결합하여 특히 섬유소 용해능력을 감소시키는 강력한 물질이다. 이는 혈관내피세포와 지방세포 등에서 주로 생성이 되어지는데, 특히 지방조직자체에서 혈중 PAI-1농도의 증가에 주된 영향을 미친다고 알려져 있다.¹⁾³⁾
섬유소 용해능력의 감소는 혈전과 관련된 질환들의 발생에 주요한 원인이 되며 실제로 혈전증이나 심근경색증 환자, 그리고 임상적으로 흔하게 접하는 비만, 폐쇄성 수면 무호흡증 환자에서 PAI-1의 증가가 보고 되고 있다.¹⁾²⁾³⁾ 1990년 Gracia 등⁴⁾이 PAI활성도의 증가와 섬유소용해 반응의 감소가 당뇨환자에서 혈관병증과 관련이 있음을 보고한 이후 많은 연구자들이 심혈관 및 말초혈관 질환들과의 연관성을 밝혀내기 위해 다양한 연구가 진행되고 있다.²⁾³⁾ 특히 인슐린비의존형 당뇨병 환자에서 PAI-1 농도에 대한 연구에 의하면 PAI-1은 이런 환자들에서 정상 대조군에 비해 증가되어 있으며 신체질량지수(BMI), 공복혈당 및 당화혈색소, 혈중 중성지방 농도, C-petide 농도 등과 같은 요인과도 연관이 있는 것으로 보고하였다.³⁾⁵⁾ 또한 Kim 등⁶⁾에 의하면 관상동맥질환의 위험요인인 PAI-1의 혈장농도는 특정 유전자 다형성과도 관련이 있는데 특히 4G/5G 다형성에서 4G형을 갖는 경우 혈장 PAI-1단백의 농도를 상승시켜 혈전 발생을 증가시킨다고 한다. 하지만 한국인을 대상으로 한 다른 보고에서는 PAI-1 유전자형과 관상동맥질환과의 연관성은 없다고 하여 논란의 여지가 아직 있는 것으로 보인다.
이비인후과 영역에서 내이의 혈액순환 장애로 인해 발생 가능한 것으로도 잘 알려진 돌발성 난청, 벨씨마비, 전정신경염, 메니에르병 등의 질환들은 아직 그 정확한 병변이나 기전이 확립되지 않은 상태이다. 따라서 본 연구에서는 PAI-1이 이처럼 내이에서 말초혈액순환의 장애를 초래할 수 있는지를 알아보기 위해 기니픽의 와우에 PAI-1을 정원창을 통해 직접 투여하여 청력의 변화 양상과 와우내 전압차이를 관찰하고자 하였다. 와우내에서의 이러한 전기 생리학적인 변화를 통하여 PAI-1과 같은 혈액순환 장애를 초래하는 물질들로 인한 상기 질환들의 발생 기전을 설명할 수 있는 한 모델을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

실험 동물 및 마취

실험동물로는 체중 250~300 g의 외견상 건강하고, 정상적인 Preyer's reflex를 보이며, 청성뇌간반응(auditory brainstem response)에서 정상 소견을 보인 기니픽을 사용하였다. 이들을 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine(2 mg/kg)을 섞어서 복강 내 주사하여 마취하였다. 이들은 청력역치의 변화 관찰을 하기 위해 대조군, 10, 20, 40 μg/ml 농도로 각각 5마리(10귀)를 사용하였으며, 와우내 전위의 변화를 관찰하기 위해 각각 3마리(6귀)의 기니픽을 사용하였다.

실험 용액

실험용액은 Plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1, Merck Ltd. Seoul, Korea)이며, 대조군에는 생리적 식염수(normal saline)를 사용하였다.

연구방법

청력역치의 측정
기니픽의 청력역치는 청성뇌간반응을 이용하여 측정하였다. 청성뇌간반응은 Traveler Express(Biologic System Co., Mundelein, IN, USA)를 사용하였다. 자극음은 초당 13회의 교대상 클릭음을 90 dBHL의 강도부터 단계별로 10 dB씩 낮추며 측정하였고, 파형이 불분명하게 나오는 음의 강도에 도달하면 5 dB씩 조절하면서 청력 역치를 측정하였다. 청력역치는 파형 Ⅰ을 기준으로 정상적인 파형 Ⅰ이 추적되는 강도를 청력역치로 정하였고, 클릭음의 주파수 필터는 100~3000 Hz로 조절하였고, 총자극음의 횟수는 1,024회로 하였다.

정원창의 노출 및 PAI-1의 투과
기니픽 두부의 털을 깨끗이 제거한 후 청성뇌간반응을 측정하기 위해 needle type의 전극을 좌우 유양동 부위와 두정부, 후두부 피부에 삽입하고 술전 청력을 측정하였다. 이후 기니픽 귓바퀴의 내측으로 약 1.5 cm 길이의 피부절개를 시행하여 골성 외이도의 후내측 부분의 골포를 노출한 다음 드릴을 이용하여 개방하여 와우의 정원창을 확인하였다. 기니픽의 정원창 노출 이후 개방시 청력에 영향이 없었는지 다시 한번 청력을 측정한 후 약물을 200 μl씩 gelfoam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 시간별로 청력역치의 변화를 측정하였다.

와우내 전위의 변화 측정
기니픽의 와우내 전위(endocochlear potential, EP)를 측정하기 위해 같은 방법으로 피부절개를 시행후 유양동을 드릴로 개방한 뒤 고막과 이소골을 확인한 뒤 이소골을 제거하여 정원창 및 와우의 회선을 확인한 후 현미경 하에서 기니픽 와우의 두 번째 회선부에 Rosen pick을 이용하여 골성미로에 구멍을 뚫었다. 이후 내림프액의 유출이 없음을 확인하고 tungsten microneedle(2.0 Mohm, WPI, Sarasota, FL, USA)을 막성미로를 뚫고 삽입한 뒤 정확히 중간계(scala media)내에 삽입되었는지를 확인하기 위해 와우내 전위를 측정하여 확인한 후 역시 약물을 200 μl씩 gelfoam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 와우내 전위의 변화를 시간별로 측정하였다. 측정기기로는 micromanipulator M3301R+M-3(WPI, Sarasota, USA)에 DAM60 amplifier(WPI)를 부착하여 사용하였으며 증폭정도는 DC 100배로 하였다. 와우내 전위 측정 프로그램으로는 comizoa CP-201 hardware/software(Comizoa Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 사용하였다.

통계분석
통계분석은 대조군과 실험군 간의 시간 경과에 따른 청력의 변화 차이와 농도의 차이에 따른 청력의 변화 차이를 고려하여 2 way ANOVA검사를 이용하였으며, 유의수준은 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

PAI-1 농도에 따른 기니픽 청력역치의 변화

대조군으로는 같은 양의 생리적 식염수를 사용하였고, 실험군은 10, 20, 40 μg/ml PAI-1을 기니픽의 정원창에 투여하여 시간별 청력역치의 변화를 측정하였다. 실험군의 대부분은 대조군에 비해 투여 후 약 30분 경과 후 청력역치가 증가하기 시작하여 투여 후 평균 2.3일을 최정점으로 한 뒤 역치가 감소하기 시작하였으며, 농도의 차이에 따른 청력역치의 변화 차이는 없었다(p<0.05)(Fig. 1). 일부에서는 청력이 회복되지 않거나, 청력이 전혀 소실되지 않은 기니픽도 있었다.

PAI-1 농도에 따른 기니픽 와우내 전위의 변화

초기 와우내 전위는 87±14 mV이었으며, 약물 투여 후 측정한 와우내 전위의 변화 관찰 시 대조군에 비해 각 농도에서 약 30분부터 전위가 감소하기 시작하여 120분까지 지속적으로 감소하는 소견을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).

고     찰

일반적으로 분자량이 500 kDa 이하인 물질은 정원창막을 통해 투과 가능하다고 알려져 있다.⁷⁾⁸⁾ 저분자량은 금방 막을 통과하나 에피네프린(200 kDa)은 20분, 520 kDa에 달하는 platelet activating factor(PAF)같은 경우엔 최고점에 이르는데 약 30~60분 정도의 시간이 필요하다고 한다.⁷⁾⁸⁾⁹⁾ 본 연구에서도 분자량이 50 kDa인 PAI-1은 정원창막을 투과하는데는 아무 지장이 없었으며, 정원창막에 올려놓은 뒤 약 30분 뒤부터 와우내 전위의 감소와 청력역치의 증가가 나타나기 시작하였다. 이는 정원창막은 금방 통과하였으나 와우에 효과를 나타내기 시작하는데 필요한 시간인 것으로 생각된다. 이처럼 정원창막을 통한 주입이 전신투여보다 나은 장점으로는 첫째, 전신적 독성효과를 피할수 있으며, 둘째로 와우에 직접 전달이 가능하고, 셋째로 전신작용에 의해 나타나는 결과와 혼동을 피할 수 있으며, 마지막으로 정상적인 와우에 비침습적일 수 있다.⁷⁾¹⁰⁾
와우의 혈액공급이 저하되면 기저막 뿐만 아니라 청신경과 유모세포의 기능도 급격히 저하된다. 즉 각 청신경의 역치가 높아지고 주파수 선택도가 떨어지게 된다. 와우기관과 순환기간에 직접적인 연결은 보이지 않지만, 혈관선조, 나선융기(spiral eminence), 기저막에 있는 모세혈관층이 혈액공급에 관여하는 것으로 추정하고 있다. Hudspeth¹¹⁾의 연구 결과에 따르면, 혈관선조는 내림프의 이온 특성을 조정하는 데 관여하고, 와우기관의 혈액은 주로 기저막에 있는 혈관에서 공급되는 것으로 추정된다고 하였다. 소염, 해열, 혈전방지 및 진통제로 널리 쓰이고 있는 salicylate는 부작용으로서 이독성(ototoxicity)이 잘 알려져 있는데, 보통 경도 내지 중등도의 난청이 발생하였다가 복용 중단 24~72시간 이후에는 사라지는 일과성으로 그 기전에 대해서는 많은 논란이 있으며, 형태학적 병소부위는 아직도 증명되지 못하고 있다. Didier 등¹²⁾에 의하면 laser doppler를 이용하여 salicylate를 투여한 후 와우혈류량 감소를 관찰하고 이는 leukotriene의 증가에 의한다는 가설을 발표하여 혈류장애로 인한 기전을 제시하였으며, 최근 이독성을 일으키는 약물들의 기전으로 자유산소기(free oxygen radical, FOR)에 의한 세포의 기능과 구조의 손상을 원인으로 생각하는 보고가 많이 되고 있다.¹³⁾¹⁴⁾ Woo 등¹⁵⁾에 의해서도 Na-salicylate의 난청 기전이 와우 혈류량 감소에 의한 허혈-재관류시 나타나는 FORs에 의한 손상으로 보고하였다. 본 연구에서의 PAI-1 주입 후 나타난 청력변화는 계속 청력감소가 일어나다가 평균 2.3일째를 경계로 하여 청력이 회복되는 양상으로 상기 이독성 약물들의 기전들처럼 와우 혈류량의 감소로 인해 코티 기관과 혈관선조에 영향을 주었을 기전과 아울러 혈류량의 감소-재관류로 발생한 자유산소기로 인한 세포손상도 가능 기전으로 생각을 할 수 있었다.
기니픽의 와우내 전위는 그 발생기전이 아직 정확하게 밝혀진 것은 없으나 Wangemann¹⁶⁾과 Hu 등¹⁷⁾은 혈관선조의 변연세포에 의해 높은 농도의 K⁺ 이온이 분비되며 이로 인해 높은 와우내 전위가 형성되며, 또한 외림프액의 pH가 5에서 9사이인 경우 정상적으로 유지되며 4이하로 감소하였을 경우 가역적인 감소를, 10이상인 경우 비가역적인 감소를 보였다고 보고하여 와우내 전위가 외림프 pH의 영향도 받는다고 하였다. 따라서 Ahn 등¹⁸⁾에 따르면 선조변연세포에서 손상을 받게 되면 vacuolar type H⁺-ATPase 기능이 저하되어 세포내 pH가 낮아지고, Na⁺-K⁺ ATPase의 정상적인 기능의 소실로 내림프로의 높은 K⁺이온의 흐름을 유지하지 못하여 와우내 전위가 감소하게 되고, 유모세포 및 감각세포들의 기능저하로 인한 청력저하를 유발한다는 기전을 설명할 수 있었다. 또한 Motohashi 등¹⁹⁾에 의하면 림프내 칼슘이온대사의 조절인자로서 역할을 하는 선조의 중간세포가 손상 받음으로 Ca ATPase와 Na-K ATPase 활동성을 감소시켜 청력소실을 야기한다고 하였다. 따라서 와우내 전압이 약간의 변화만 생겨도 청신경의 전달속도에 많은 영향을 미칠 수 있기 때문에 H⁺ 이온의 내림프 내로의 배출은 생리학적으로 매우 중요한 의미를 지닌다.
Seo 등²⁰⁾에 의하면 인슐린 비의존형 당뇨환자에서 혈장 PAI-1 항원 농도의 측정은 증식당뇨망막병증의 발생 및 진행에 유용한 지표가 될 수 있을 것을 제시하였다. 이처럼 PAI-1이 각종 말초혈관계 질환의 다양한 척도가 될 수 있다는 것을 참고하여 본 실험의 결과를 토대로 임상적으로 돌발성 난청, 벨씨마비, 전정신경염과 같은 내이의 혈액순환장애로 인해 발생 가능한 질환들을 가진 환자들 80례에서 혈중 PAI-1 농도를 측정해 본 결과 당뇨병, 신체질량지수, 말초혈관계 질환 등의 요소들을 감안하였음에도 통계학적으로 의미가 없을 정도의 수치(p>0.05)로 증가해 있었다. 이는 질환들의 원인이 내이의 혈류장애가 아닌 다른 것이었을 수도 있지만, 신체내 다양한 요소들의 미치는 영향이 있을 수 있으며, 또한 PAI-1 혈장농도는 일내변동이 많고 생리적 조건에서도 반감기가 짧아 검사시 엄격한 표준화가 요구되는 검사이므로 많은 연구결과가 실제 인체내 PAI-1 농도를 반영하지 못하였을 가능성이 있다.³⁾ 따라서 실제질환들에서의 농도 측정과 전신 투여후의 변화 관찰은 신중히 많은 요소들의 영향을 더 고려하여 연구되어져야 할 것이다.
앞으로 본 연구에서의 결과를 토대로 하여 향후 PAI-1의 전신적 투여에 따른 와우에서의 변화양상을 확인하는 추가 실험이 더 필요할 것으로 생각되어 지며, 임상적으로도 PAI-1의 농도가 증가되어 있는 대상에서의 내이질환 발병 양상의 인과 관계가 확실히 밝혀진다면 이러한 질환의 치료적 접근에 있어서도 큰 도움이 될 것이라 생각한다.

결     론

기니픽의 정원창을 통한 PAI-1을 직접적으로 투여한 후 청성뇌간유발반응검사에서 청력역치의 일시적 상승과 와우내 전위의 감소된 소견을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 와우내의 혈류장애를 청각학적 변화를 통해 간접적으로 제시할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 PAI-1을 통한 와우에서의 변화를 통해 내이 미세혈관계의 혈류장애로 인한 내이질환들의 발생 기전을 설명할 수 있는 하나의 모델을 제시할 수 있을 것으로 생각한다.

REFERENCES

Nam SJ, Cho SR, Kim CS, Woo SG, Choi HJ, Kim SK, et al. Plasma Concentrations of Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1) and Lipoprotein (a) in Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus with Peripheral Vascular Disease. J Korean Diabetes Assoc 1999;23(1):55-61.
Yoon JW, Jo SK, Han SY, Cha DR, Cho WY, Kim HK. Polymorphisms of Angiotensin Converting Enzyme and Plasminogen Activator Inhibitor-1 Genes in Diabetic Nephropathy and Macroangiopathy in NIDDM Patients. Korean J Nephrol 2001;20(4):565-75.
Kim HK, Kim CH, Shin ES, Kim HJ, Park JY, Hong SK, et al. Plasminogen Activator Inhibitor (PAI-1) Levels in Patients with non-insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM). J Korean Diabetes Assoc 1997;21(1):29-38.
Garcia Frade LJ, de la Calle H, Torrado MC, Lara JI, Cuellar L, Garcia AA. Hypofibrinolysis associated with vasculopathy in non insulin dependent diabetes mellitus. Thromb Res 1990;59:51-9.
Ma LJ, Mao SL, Taylor KL, Kanjanabuch T, Guan YF, Zhang YH, et al. Prevention of obesity and insulin resistance in mice lacking plasminogen activator inhibitor 1. Diabetes 2004;53(2):336-46.
Kim HK, Song KS, Jee SH, Shim W, Shin JS. Fibrinogen, Factor VII and Plasminogen activator inhibitor-1 genotypes and the risk of coronary artery disease. Korean J Hematol 2001;36(1):79-89.
Ohlsen KA, Baldwin DL, Nuttall AL, Miller JM. Influence of topically applied adrenergic agents on cochlear blood floor. Circ Res 1991;69:509-18.
Hamaguchi Y, Morizono T, Juhn S. Round window membrane permeability to human serum albumin in antigen-induced otitis media. Am J Otolaryngol 1988;8:34-40.
Cho YS, Park JH, Kim JS, Lim JL. Effect of Platlet activating factor (PAF) on cochlear blood flow in guinea pig. Korean J Otolaryngol 2000;43:799-803.
Rhee CK, Jeon SJ, Park BK, Oh CH, Choi WI. iNOS expression in inner ears of guinea pigs injured by PAF. Korean J Otolaryngol 2003;46:1005-11.
Hudspeth AJ. Sensitivity, polarity, and conduction change in the response of vertebrate hair cells to controlled mechanical stimuli. Proc Natl Aca Sci 1977;74:2407-11.
Didier A, Nuttall AL, Miller JM. Vascular component of sodium salicylate ototoxicity in the guinea pig. Hear Res 1993;69:199-206.
Schweitzer VG. Cisplatin-induced ototoxicity: the effects of pigmentation and inhibitory agents. Laryngoscope 1993;103:1-52.
Clerici WJ, Hensley K, DiMartino DL, Butterfield DA. Direct detection of ototoxicant-induced reactive oxygen species generation in cochlear explants. Hear Res 1996;98:116-24.
Woo HY, Chai YH, Kang MW, Lee CH, Choi JH, Cho KR. The protective effect of free oxygen radical inhibitors on Na-salicylate induced cochlear damage in guinea pig. Korean J Otolaryngol 2001;44:914-9.
Wangemann P. Potassium ion secretion and generation of the endocochlear potential in the stria vascularis. HNO 1997;45:205-9.
Hu BH, Jiang SC. Effect of focal cochlear vascular lesion on endocochlear potential in guinea pigs. Hear Res 1995;89:69-75.
Ahn JH, Kang HH, Chung JW. The change of hearing threshold and endocochlear potential by Bafilomycin delevered to round window in guinea pig. Korean J Otolaryngol 2004;47:524-9.
Motohashi H, Hozawa K, Oshima T, Takeuchi T, Takasaka T. Dysgenesis of melanocytes and cochlear dysfunction in mutant microphthalmia mice. Hear Res 1994;80:10-20.
Seo JB, Yoo JS, Huh W. The relationship between plasma PAI-1 antigen concentration and diabetic retinopathy in NIDDM patients. J Korean Ophthalmol Soc 2000;41(1):127-32.