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Auditory and vestibular disorders
Korean Journal of Audiology 2010;14(1):12-15.
Expression of Glial Fibrillay Acidic Protein in the Central Auditory Pathway of Rats after Loud Noise Exposure
Ki-Hong Chang, Sun-Young Jin, Jae-Won Park, Go-Eun Park, Kyung-A Lee, Beom-Cho Jun, Sang-Won Yeo
Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, The Catholic University of Korea College of Medicine, Seoul, Korea
백서 중추청각계에서 강한 소음 자극 후에 Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)의 발현
장기홍, 진선영, 박재원, 박고은, 이경아, 전범조, 여상원
가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
Abstract

Background and Objectives
The goal of this study was to identify astrogliosis (gliosis of astrocytes) in the central auditory pathway after acoustic trauma by expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), which may induce the functional and structural change of neuron.



Materials and Methods
Six male adult Sprague-Dawley rats were exposed to 130 dB SPL white noise (125-8,000 Hz) for 2 hours. 3 days after the sound stimuli, rats were sacrificed. Two normal control rats were sacrificed without the treatment. The brains of rats were prepared by including the cochlear nucleus and inferior colliculus. The brains were stained for c-fos (proto-oncogene proteins) and GFAP with immunofluorescent staing method.



Results
Expressions of c-fos and GFAP in the cochlear nucleus, trapezoid body and infeior colliculus were more prominent in the noise exposure group than those of the control group. 



Conclusions
These results show that acoustic trauma may induce astrogliosis along the afferent auditory circuit. It may suggest that peripheral changes by loud sound could induce functional and physiologic alterations in the auditory system via astrogliosis of auditory pathway.

Keywords: Gliosis;Auditory pathway;Central;Acoustic truma;Glial fibrillary acidic protein.

Address for correspondence : Beom-Cho Jun, MD, Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Catholic University of Korea College of Medicine, 65-1 Geumo-dong, Uijeongbu 480-821, Korea
Tel:+82-31-820-3657, Fax:+82-31-847-0038, E-mail:otojun@catholic.ac.kr


서     론

성상교세포(astrocyte)는 중추신경의 회색질(gray matter)를 구성하는 주된 아교세포(glial cell)로 과거에는 주로 뇌의 신경원을 외형적으로 지지하는 기능을 하는 것으로 알려져 왔으나1) 최근에는 발생단계 혹은 성체에 있어서도 시냅스 기능 및 지지구조 변화로 인한 신경가소성과 시냅스 전도에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다.2) 중추신경계의 외상, 질환 및 노화와 관련하여 성상교세포의 수와 크기, 섬유질의 특징이 변화하는 astrogliosis에 대해 많은 연구가 되고 있으며3,4,5,6,7) 이는 신경원의 손상으로 인한 성상교세포의 반응적 변화로 중추신경계의 주요질환인 amyotrophic lateral sclerosis에서 나타나는 주된 병리소견 중의 하나이기도 하다.8)
Glial fibrillary acidic protein(GFAP)은 성상교세포의 중간미세섬유단백으로 GFAP의 발현이 astrogliosis 조절의 표식자로 이용되고 있다.9) GFAP의 발현은 여러 단계의 외상 후 신호와 신경활성도에 의해 조절된다고 알려져 있다.10) 이에 저자들은 소음성 외상 후 중추청신경계 내에서 GFAP 발현을 통해 확인해 봄으로써 소음성 외상이 중추 청신경계에서 astrogliosis와 관련된 구조 및 시냅스 기능의 변화를 유도할 수 있는지 알아보고자 연구를 계획하였다. GFAP의 발현이 소음 자극과의 관련되어 있는지 알아 보기위해 자극에 대해 활성화된 신경원에서 조기 발현하는 c-fos에 대해서도 double stain하였다.

재료 및 방법

생후 30일 이상의 백서(Sprague-Dawley rat)를 대조군과 실험군으로 각각 2마리와 6마리로 나누었다. 실험 전 대조군과 실험군 모두 ketamine hydrochloride(80 mg/ kg) 근육 주사로 마취시킨 후 실험 전 쥐의 양측 고막을 현미경으로 관찰하여 중이염 및 고막천공 등의 이상이 없는지 확인하였고, Preyer's reflex로 청각 반응 여부를 확인하였다. 이후 실험군 쥐 6마리에 130 dB SPL의 백색잡음(250
~8,000 Hz)을 sound level meter로 확인한 후 2시간 동안 노출시켰다.
소음 노출 3일 후에 실험군 쥐 6마리에 4% paraformaldehyde와 phosphate buffered saline(PBS)으로 심장관류 고정(cardiac perfusion) 후 뇌를 적출하였다. 뇌의 냉동 동결은 와우핵부터 하구(inferior colliculus)까지 40 μm 두께로 조직절편을 얻고 free floating method를 이용하여 1:200으로 희석한 anti-mouse GFAP antibody(Lab Vision, Freemont, CA, USA)와 1:5,000으로 희석한 anti-rabbit c-fos antibody(Calbiochem, Darmstadt, Germany)를 double stain 시켰다. Fluorescein iso-thiocyanate(FITC)로 면역형광 염색을 하여 각각 다른 filter로 형광현미경(BH2-RFL-T3, Olympus, Japan) 관찰한 후 획득한 영상을 프로그램(DP controller 2004, Olympus, Japan)에서 합성시켰다.

결     과

환경잡음이 20 dB SPL인 상태에서 소음자극을 주지 않은 대조군에 비하여 백색 소음으로 자극한 쥐에서는 GFAP와 c-fos가 청각회로를 따라 많이 발현되었음을 확인할 수 있었다. 청각핵 중 와우핵(cochlear nucleus)에서는 GFAP와 c-fos가 청신경의 root와 연접하는 복측 와우핵의 표층에서 심부를 따라 발현되었고, 능형체(trapezoid body)와 하구에서는 교련(commissure)과 하구 외피질(external cortex of the inferior colliculus) 부위에서 발현되는 것이 관찰되었다(Fig. 1).

고     찰

뇌의 구조 및 기능의 발달과 관련하여 아교세포(glia)가 중요한 역할을 한다는 것은 이전부터 알려진 사실로 특히 과립세포(granular cell)가 glial process를 따라 이동하는 것이 확인되었고,11) 축삭(axon)의 성장에 있어 radial glia가 성장을 인도하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.12) 신경계의 발달과 관련된 지표로 이용되는 GFAP는 중추청각계에서 복측 와우핵의 발달과 관련되어 tonotopic axis의 형태를 만드는 데 중요한 역할을 한다고 보고되었으며13) 또한, 성체에 있어서는 말초기관인 경고실에 tetrodotoxin 주입 후 혹은 와우제거 후에 중추인 와우핵에서의 GFAP발현을 관찰하였고14) 노화와 관련하여 백서의 와우핵에서 발현이 증가함을 보고한 바 있다.15)
중추신경계의 고전적인 기본 개념은 성인이 된 후에는 신경이 재생되거나 발달할 수 없다는 것이었으나, Hebb16)가 새로운 환경을 경험하면 신경의 연결에 변화가 일어나는 현상이 일생을 통해 일어나는 것을 제시하였고 성인의 중추신경계는 비록 제한되어 있지만 재생능력을 가지고 자극에 대한 구조와 기능이 변화됨이 밝혀지고 있다. 이렇게 일생 동안 지속적으로 경험에 의해 뇌의 신경경로의 개조와 재조직이 일어나는 현상을 뇌의 신경가소성(neuroplasticity)이라 하며17) 새로운 기술의 습득이나, 학습과 기억의 기본기전이 된다.
이에 본 저자들은 강한 음향외상성 자극 이후 발생하는 중추 청신경계의 변화에서 성상세포의 관련성을 알아 보고자 GFAP의 발현양상을 비교하여 보았다. 또한 자극 직후의 반응이 아닌 최소한 3일 정도 지속되는 중추 청신경계내의 변화를 보기 위해 소음 노출 3일 후에 염색을 시행하였다.
실험결과 대조군에 비하여 실험군에서 GFAP의 발현이 확연하게 증가됨을 확인할 수 있었다. GFAP의 발현이 증가되었다는 것은 성상세포 수의 증가 혹은 섬유소의 상태가 변화했다는 것이고, 청각전도계의 구조 및 시냅스의 기능변화를 유추할 수 있다. 앞에서 말한 신경가소성의 관점에서 보면 중추 청신경계에서 소음자극으로 인해 손상받은 신경세포의 치유반응(scar reaction)에 관련되며 이는 신경로를 새롭게 재조직이 일어나게 만드는 현상으로 볼 수 있을 것이다. 이와 같은 변화가 소음 외상 후의 청각기능과 관련된 난청, 이명 등의 다양한 신경학적 증상과 관련된 하나의 기전일 가능성이 있으나, 보다 구체적인 설명을 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것이다. 본 연구와 동반되어 함께 시행한 c-fos는 자극에 의하여 활성화된 신경원에서 발현하는 조기전사인자(immediate early transcriptional factor)로 청각중추에서의 c-fos 발현은 활성화된 신경원의 분포를 관찰하는 데 유용한 표지자로 이용되고 있으며,18,19) c-fos의 발현이 증가되었다는 것은 소음자극 후 해당 핵에서의 활성화된 신경세포가 있음을 알 수 있어 GFAP의 발현이 소음 자극과의 관련되어 있는지 알아 볼 수 있다. 다만 c-fos의 발현 부위와 GFAP가 정확히 일치하지 않는 이유는 발현 부위가 c-fos는 주된 청신경원의 세포핵인데 비해 GFAP는 신경교세포의 세포질 부위인 차이점 때문일 것이다. 본 연구의 제한점은 GFAP와 c-fos가 발현이 증가된 것을 형광염색을 통해 육안 비교로만 확인하였고 이를 정량화하지 못한 점으로, 추후 연구에서 보다 정확한 분석이 필요할 것이다. 따라서 발현의 정도를 보다 정량적으로 평가하고 실험에 사용된 백서의 개체 수를 증가시키고 소음 노출 후 시간경과에 따른 변화의 추이를 관찰한다면 더욱 의미 있는 결론을 낼 수 있을 것이라 기대된다. 


결     론

소음자극을 준 쥐에서 GFAP와 c-fos의 발현이 청각핵에서 증가함을 확인할 수 있었고, 이는 청각신경로의 주행 변화와 재조직을 의미한다고 볼 수 있다. 본 연구 결과는 중추청각신경계에 발생하는 다양한 청각질환들의 병태생리의 규명에 도움이 될 수 있으리라 생각된다.


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