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Genetics
Korean Journal of Audiology 1997;1(2):143-148.
Typing of Human Leukocyte Antigen in Patients with Sudden Sensorineural Hearing Loss-Preliminary Report
Sang-Won Yeo, Hae-Seop Park, Ki-Hong Chang
Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, College of Medicine, Catholic University, Seoul, Korea
돌발성 난청 환자에서 인체 백혈구 항원(HLA)의 형별분석(Ⅰ)
여상원, 박해섭, 장기홍
가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
Abstract

The pathogenesis of sudden sensorineural hearing loss may be related with abnormal immune response, especially autoimmunity. And it has been known that autoimmune disease had an association with certain type of HLA. The purpose of this study was to investigate the association between HLA gene and development and prognosis of sudden sensorineural hearing loss. We performed the typing of HLA by serologic test for HLA-A and B and by reverse dot hybridization for HLA-DR in 19 patients with sudden sensorineural hearing loss and 206 healthy persons without any ear disorders. Initial and final thresholds of pure tone audiometric test in 15 patients with sudden sensorineural hearing loss with specific HLA subtypes were compared. HLA-B13 was significantly associated with development of sudden sensorineural hearing loss. Association of recovery from hearing disturbance with HLA-DRB8 was found. Several types of HLA genes were shown to be associated with susceptability to sudden deafness and recovery from hearing loss even though the size of sample was small. These results suggest that particular HLA gene products may confer the susceptability to sudden sensorineural hearing loss and recovery. 

Keywords: Human leukocyte antigen;Sudden sensorineural hearing loss;Autoimmunity.
서론 아직 정확한 원인 및 발병기전이 밝혀지지 않은 내이질환들과 면역기능 이상 및 자가면역과의 관련성을 밝히기 위한 실험연구와 임상조사가 보고되고 있다.1-5) 그중에서는 다른 자가면역질환과 같이 내이질환과 인체 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA) 형별과의 연관성을 조사하여 발표한 보고들이 있으나6-10) 그 결과가 상이하고, 특히 돌발성 난청과의 관련성에 대한 연구는 대상 환자의 수가 매우 적었으며 민족간의 차이로 인한 특성이 간과되어 있다. 일부 인체 백혈구 항원과의 관련성이 밝혀진 질환에서 인종에 따라 각기 다른 형별과 관련이 있으며 인체 백혈구 항원 형별이 인종이나 민족에 따라 매우 다른 분포와 빈도를 보이는 점11)12)으로 미루어 한국인에서 돌발성 난청 환자와 인체 백혈구 항원 형별과의 연관성을 조사하는 것은 내이질환들의 면역학적 관련성과 인체 백혈구 항원의 역할을 연구하는데 많은 기여를 할 것으로 생각된다. 국내에서는 아직까지 이에 대한 보고가 없어 저자들은 돌발성 난청을 앓고 있는 환자들의 인체 백혈구 항원의 형별분석을 시행하여 특정 항원과의 관계를 알아보고 또한 이들과 청력손상의 정도 및 회복 정도와의 관련성을 조사하여 이를 기초로 향후 돌발성 난청의 면역유전학적 발생기전과 진단 및 면역유전학적 치료의 발전에 기여하고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법 대상 1996년 10월부터 1997년 9월까지 과거에 전신적인 면역질환을 앓았던 기왕력이 없으며 뚜렷한 발생원인을 알 수 없는 돌발성 난청 환자 19명과 과거에 귀질환을 앓은 과거력이 없으며 청력검사상 정상청력을 갖고 있는 성인 206명을 대상으로 하여 HLA-A, B, DR의 subtype을 비교하였고 19명의 환자 중 치료 시작 후 최소 2주 이상 추적관찰이 가능했던 15명을 대상으로 HLA subtype과 초기 청력손실 정도 및 청력회복 정도와의 연관성을 연구하였다. 인체 백혈구 항원의 형별분석 Class Ⅰ 분자 5 cc의 혈액을 채취하여 density-gradient centrifuge하여 임파구를 분리하고 각 인체 백혈구 항원에 대한 항체가 포함된 HLA plate kit에 점적하여 항원-항체반응을 유발하고 가토에서 추출한 보체를 첨가하여 보체의존성 세포독성반응을 일으켜 Eosin대조염색하에 HLA-A와 HLA-B의 표현형을 분석하였다. 13) Class Ⅱ 분자 HLA-DRB1 유전자중 hypervariable region인 exon2 부위에서 각 대립유전자에 특이한 염기서열을 택하여 probe를 제작하였고 이들을 효율적으로 결합시키기 위해 5'에 allele specific probe를, 3에 T7 blue plasmid에 특이한 U-19mer primer의 염기서열을 연결한 ‘probe-primer’를 제작하여 T7 promoter primer와 함께 T7 blue plasmid를 target DNA로 하여 PCR로 증폭하고 이를 immobilizing probe로 사용하였다. Sample에 PCR-K buffer를 첨가하고 58℃에서 60분간 처리하고 용해시킨 다음 95℃에서 10분간 처리하여 proteinase K를 불활성화시켜 DNA를 추출하였다. DNA 시료 1 μl에 X10 PCR buffer, 2 mM dNTP, left-right primer 20 ng, Taq DNA polymerase, D/W를 섞은 혼합액 9 μl를 가한 총 10 μl를 35 cycle로 증폭시켰다. PCR로 증폭한 immobilizing probes를 0.4N NaOH, 25 mM EDTA로 10분간 변성시킨 후 nylon membrane에 점적하고 80℃ vacuum-dry oven에서 1시간동안 처리하였다. 탐색자가 점적된 membrane을 교잡용액(5×SSC, 0.5% blocking reagent, 0.1% N-lauroysarcosine, Na-salt, 0.02% SDS) 500l μl로 1시간동안 42℃에서 전교잡시킨 후 digoxigenin으로 표지된 DRB1 probe와 증폭 DNA를 교잡용액에 섞어 2시간동안 반응시킨 후 0.1% SDS와 2X SSC 및 TMAC solution으로 세척하였다. 이어서 alkaline phosphatase가 결합된 anti-digoxigenin antibody를 이용하여 반응시키고 NBT와 X-phosphate로 염색후 유전자형을 분석하였다.14) 통계분석 정상대조군과 돌발성 난청 환자에서 HLA의 각각의 subtype들의 발현빈도와 HLA subtype에 따른 돌발성 난청의 초진시 청력손실 정도 및 회복 정도와의 관계를 통계프로그램인 SAS(statistical analysis system, version 6.04)를 이용하여 분산분석하였으며 p-value가 0.05 이하인 경우를 유의하다고 판정하였다. 결과 정상 대조군에서의 인체 백혈구 항원 형별 분석 인체 백혈구 항원 A형(HLA-A)에서는 한국인에서 높은 빈도를 보이는 2, 11, 24, 33형의 빈도가 높게 나타났으며(Table 1), HLA-B에서는 13, 35, 51, 58, 61, 62형이 많았고(Table 2), HLA-DR에서는 2, 4, 8, 9, 13형이 많아(Table 3), 대체적으로 한국인의 인체 백혈구 항원 형별 분포와15) 유사한 양상을 보였다. 돌발성 난청 환자에서 인체 백혈구 항원 형별 분석 돌발성 난청 환자에서 HLA-B13의 발현이 통계적으로 유의하게 높았다. HLA-A26과 30, HLA-B27, 39와 52, HLA-DRB7, 11과 12의 발현은 정상대조군에 비해 발현 빈도가 높았으나 통계적인 유의성은 없었다(Table 1, 2, 3). 돌발성 난청 환자의 초기 청력손실 정도와 회복 정도 초기 청력손실 정도 초진시 경도의 청력손실(26~40 dB)을 보인 예가 2례, 중등도의 청력손실(41~55 dB)을 보인 예가 3례, 중등고도의 청력손실(56~70 dB)을 보인 예가 7례, 고도의 청력손실(70 dB이상)을 보인 예가 4례였으며 이들 중 한 예에서는 발병 1개월 후 반대측에도 돌발성 난청이 발생하였다(Table 4). 회복 정도 청력회복의 판정기준은 Siegel 16)의 분류를 사용하였으며, 치료 시작 후 최소 2주가 지난 후의 청력을 기준으로 하여 최종 청력이 25 dB 이내인 경우가 3례, 15 dB 이상의 청력 회복이 있었으며 최종 청력이 25~45 dB 사이인 경우가 3례, 15 dB 이상의 청력 회복이 있었으며 최종 청력이 45 dB 이상인 경우가 1례, 15 dB 이하의 청력 회복을 보인 예가 8례, 최종 청력이 75 dB 이상인 경우가 1례였다(Table 5). 인체 백혈구 항원 형별에 따른 청력손실과 회복의 정도 HLA-DRB8이 발현된 환자에서 청력회복 수준이 통계적으로 유의하게 높았다. 그러나 그 외의 환자에서는 발현된 인체 백혈구 항원의 형별에 따른 청력회복 혹은 청력악화의 차이를 관찰할 수 없었다. 또한 돌발성 난청 환자에서 청력손실의 정도와 인체 백혈구 항원의 발현과의 연관성도 관찰되지 않았다(Table 6). 고찰 인체 백혈구 항원은 사람의 6번 염색체의 단완(short arm)에 위치한 주조직적합체(Major Histocompatability Complex, MHC) 유전자에 의해 합성되며, 면역체계에서 세포와 세포간의 상호작용에 중심적인 역할을 하는 동종 항원이다. 조직내의 분포와 구조에 따라 Class Ⅰ 분자와 Class Ⅱ 분자로 분류되는데 Class Ⅰ 분자에는 HLA-A, HLA-B, 그리고 HLA-C 분자가 포함되며 이들은 체내의 모든 유핵세포 표면에 표현되어 면역반응에서 세포독성 T 임파구의 표적으로 기능한다. Class Ⅱ 분자에는 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP 등이 포함되며 주로 B 임파구나 대식세포 등의 항원제시세포(Antigen presenting cell)와 활성화된 T 임파구에 표현되어 가공된 펩타이드 항원을 CD4+ T 임파구에 인식시키는 기능을 한다.13) 인체 백혈구 항원은 다형성(Polymorphism)을 가져 Class Ⅰ 분자는 현재까지 알려진 41종류의 A 대립유전자, 61종류의 B 대립유전자와 18종류의 C 대립유전자에서, Class Ⅱ 분자는 60종류의 DRB1, 14종류의 DQA1, 19종류의 DQB1, 그리고 38종류의 DPA1 대립유전자에서 전사되는 많은 표현형을 가지고 있으며 인종, 민족, 지역에 따라 독특한 표현빈도를 보인다. 또한 인체 백혈구 항원은 유전자 결연 불균형(Linkage disequilibrium)이라는 유전자 발현의 특징을 갖는데 이는 대립 유전자의 조합 과정에서 일배체형(Haplotype)으로 관찰되는 대립유전자들의 발현빈도가 각각의 대립유전자의 발현빈도로 추정한 기대치보다 훨씬 높게 나타나는 것이다.13) 이러한 다양성과 면역체계에서의 기능으로 보아 특정 인체 백혈구 항원은 어떤 질환의 발병에 대한 감수성과 관련이 있을 수 있다는 추측 아래 많은 질환, 특히 자가면역성 질환, 유전성 질환, 감염 질환 등과의 관련성이 연구되어 왔다. 대표적인 예로 강직성 척추염은 HLA-B27, 류마티스 관절염은 HLA-DR4, Sjogren씨 증후군은 HLA-DR52, 인슐린의존성 당뇨병은 HLA-DQW8 등이 연관되어 있는 것으로 보고되었다.13) 주조직적합체의 특정 인체 백혈구 항원이 질병의 발생에 작용하는 기전에 대해 여러 가지 가설이 알려져 있다. 하지만 어느 한가지 기전으로만 발생한다기 보다는 여러 가지 요소가 복합되어 발생하는 것으로 생각되고 있다. 일반적으로 면역 이상에 의한 내이질환의 발병에는 유전학적 감수성과 환경요인의 상호작용이 요구되며 실제로 많은 자가면역성 질환들은 특히 D/DR 유전자좌로 기록되어 있는 인체 백혈구 항원들과의 연관성을 보여주고 있다.7)8)13) 특정 인체 백혈구 항원-연결성 면역 반응 유전자들(Ir genes)이 자가항체성 반응의 양을 조절하며, 또한 인체 백혈구 항원 유전자들은 임파구 상호 작용들의 조절에 관여하므로 비정규적 면역조절을 통해서 자가면역에 대한 영향을 나타나게 된다.13)17) 한편 Cytomegalovirus나 Parvovirus 등의 바이러스 감염이 유전학적으로 감수성이 있는 환자에서 바이러스와 MHC class Ⅱ 분자간의 공통된 구조로 인해 자가면역반응을 일으킬 수 있고18)19) 특정 인체 백혈구 항원이 바이러스나 독소에 대해 세포 표면 수용체로 작용할 수도 있으며 서로 다른 유형의 인체 백혈구 항원이 각기 다른 반응을 보일 수 있다. 또한 Class Ⅰ 항원의 경우 세포 독성 T 세포의 작용이 특이성을 가질 수도 있다. 내이 질환과 자가면역이 관련이 있을 수 있다는 근거로는 베게너 육아종증, 류마티스성 관절염, 결절성 다발성 동맥염, 재발성 다발성 연골염, 전신성 홍반성 루프스 등의 전신적 자가면역성 질환에서 내이증상이 발현되기도 하며, 동물실험과 인체연구를 통해 자가항체의 생성, 면역복합체 침착, T 임파구 중개성 자가면역성 등이 관찰되므로서20) 아직 발생원인이 불분명한 내이질환에서 면역학적 이상이 내이손상의 한 원인이 될 수도 있음을 시사하고 있다. 이에 따라 내이질환과 인체 백혈구 항원과의 관련성도 연구가 되어 돌발성 난청, 이경화증, 메니에르병 및 원인미상의 만성적 감음신경성 난청등에서 특정 인체 백혈구 항원과의 관련성이 보고된 바 있다.6-10) Xenellis 등9)은 메니에르병 환자의 75%에서 HLA-Cw7 항원을 가지고 있었으며 HLA-A1과 B8의 빈도가 대조군에 비해 높다고 하였고 Bowman 등10)은 자가면역성 감음신경성 난청에서 다른 인체 백혈구 항원과의 연관성은 없었으며 단지 HLA-DR4의 빈도가 감소하였다고 하였다. Bernstein과 Yoo 등8)은 감음신경성 난청과 이경화증 환자에서 HLA-A1/B8/DR3 일배체형의 빈도가 의의있게 높았다고 하였고 원인미상의 진행성 감음신경성 난청에서 인체 백혈구 항원 class Ⅱ 관련성을 유전자 수준에서 조사한 Cao7) 등은 HLA-DRB1 0301, HLA-DRB3 0101, HLA-DQB1 0301, HLA-DPB1 0401의 빈도가 의의있게 높았고 HLA-DQB1 0301의 빈도는 의의있게 감소하였다고 하였다. 반면 Xu 등6)은 원인미상의 감음신경성 난청에서 의의있게 발현 빈도가 높은 HLA 항원을 찾을 수 없었다고 보고하여 보고자들에 따라 상이한 결과를 보였다. 또한 이런한 보고들의 대상이 된 내이질환에서 돌발성난청 환자의 수는 매우 적은 편이었으며 예후와의 관계에 대해서도 보고가 없었으며 인체 백혈구 항원 형별은 인종, 민족간에 빈도의 차이가 많아 동일한 인종에서 정상대조군과 환자군을 비교하여야 하고 외국의 연구결과를 한국인에게 적용시키는 것은 적당하지 않을 수 있다. 인종간 차이의 예로 자가면역성 갑상선질환에서 백인의 경우 HLA-B8과 관련성이 높으나 일본인에서는 HLA-B35, 중국인에서는 HLA-Bw46, 한국인에서는 HLA-A11과 HLA-DR w8과의 관련성이 높은 것으로 보고되었다.11)12) 돌발성 난청과 인체 백혈구 항원과의 관련성에 국한한 본 연구에서는 HLA-B13형이 돌발성 난청의 발생빈도와, HLA-DRB8은 돌발성 난청의 청력회복과 통계적으로 의의있는 관련성을 보였다. HLA-A26과 30, HLA-B27, 39와 52, HLA-7, 11과 12들은 정상대조군에 비해 돌발성 난청 환자군에서 발현 빈도가 높았으나 통계적인 의의가 있는 수준은 아니었다. 발현빈도가 높은 일배체형은 본 연구에서는 발견되지 않았다. 인체 백혈구 항원 연관성에 대한 연구의 특징상 많은 대상이 요구되나 조사의 초기단계인 본 연구에서는 아직 연구대상의 수가 적어 그 관련성에 대해서는 지속적인 연구가 필요하다. 또한 인체 백혈구 항원에서는 감수성이 적은 항원도 발견될 수 있지만 본 연구에서는 아직 찾을 수는 없었다. 그러나 기존 한국인에서의 인체 백혈구 항원 빈도 분포와 정상대조군의 인체 백혈구 항원 빈도 분포에서 낮은 빈도를 보인 인체 백혈구 항원 형별들이 돌발성난청 환자군에서 발현 빈도가 높았다는 것은 매우 흥미있는 점이며 향후 계속될 연구에서 보다 관심을 가지고 연관성에 대해 연구해야 할 것으로 생각된다. 아울러 내이항원에 대한 항체 형성과의 관계 및 유전자 결연 불균형에 의한 일배체형과의 관련성에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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