| Expression of PKC and VDCC mRNA Subunits in Auditory Brainstem Nuclei |
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Seung Hoon Han, Hak Hyun Jung, Han Kyu Suh, Soon Jae Hwang, Hyun Ho Lim |
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Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea |
| 흰쥐 청각뇌간핵에서 PKC와 VDCC유전자 Subunit의 발현 양상 |
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한승훈, 정학현, 서한규, 황순재, 임현호 |
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고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| Abstract |
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Protein kinase C (PKC) and voltage dependent calcium channel (VDCC) have a central role in the mechanism of intracellular signal transduction. PKC become activated by various extracellular stimuli including hormones, growth factors, and other neurotransmitters to phosphorylate enzymes, receptors and ion channels to control various intracelluar events. VDCC are activated by voltage changes leading to intracellular mobilization of calcium ions and thus controlling neurotransmitter release and neuronal excitation. The objective of this study was to determine the distribution of PKC (α, β, γ, δ, ε, ζ) and VDCC (L, N, P, R) subunits in the auditory brainstem nuclei by using in situ hybridization histochemistry. The results of the study shows that PKC δ and γ showed the strongest expression in inferior collicus, and also PKC δ showed a high expression level in superior olivary complex. Among the VDCC subunits, subunit L-type showed a strong expression pattern in superior olivary complex. These results suggest a possible role for PKC δ, γ, and VDCC L-type in central auditory function of the rat. The results of this study indicate an importance of molecular genetics in the signal tranduction of central auditory pathways, also high expression in superior olivary complex and inferior colliculus may suggest a crucial role of these structures in the auditory pathways of the central nervous system.
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| Keywords:
PKC;VDCC;Auditory;Signal transduction;Brainstem nuclei |
서론
생체를 구성하는 조직의 기본 단위인 세포는 변화하는 환경에 대응하고, 항상성을 유지하기 위하여 외부의 다양한 자극과 정보 등을 받아 여러 전달과정을 거쳐 외부의 신호에 대해 반응한다. 이에 따른 결과로써 분화 및 성장 등과 같은 일련의 복잡한 반응이 나타나는데 이러한 세포의 반응기전은 외부자극들로 작용하는 여러 가지 신호 즉 일차신호전달물질인 호르몬, 성장인자, 신경전달물질 및 다른 길항물질들이 세포막에 있는 특이수용체와 결합하게 되고 이 결합으로 외부의 정보가 세포 내로 전달되어 이차신호전달물질을 생성함으로써 시작된다. 이차신호전달물질로는 cAMP와 cGMP가 이미 잘 알려져 있고 최근에 inositol phospholipid에서 생성되는 전압의존성 칼슘채널(voltage dependent calcium channel, VDCC),1) phospholipase C,2) protein kinase C(PKC),3) inositol triphosphate kinase 및 receptor 등4)이 알려져 있다.
이차신호전달물질들의 대사 과정은 최근에 청각경로에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다. 최근 흰쥐의 와우와 전정감각 세포에서 연구가 되어지고 있으며5) 각각의 신호전달물질의 전기생리학적 연구가 진행되어 오고 있지만 청각기관에서의 분포에 대하여는 보고가 없는 실정이다. 최근에 급격히 발달되는 분자생물학적 기법들로 인해 각각의 이차신호전달물질을 생성하는 유전자의 염기서열이 밝혀짐에 따라 그 유전자의 분포에 관한 연구가 활발해지고 있다. 이비인후과 영역에서 in situ hybridization방법은 Wackym 등 6)에 의해 처음 사용되었으며, 이들은 전정핵에서 calcitonin gene related peptide(CGRP)의 발현을 보고하였다. 그 후 이비인후과 영역에서도 여러가지 신호전달물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직까지 이차신호전달물질들이 중추청각경로에서의 분포와 어떠한 역할을 하고 있는지는 밝혀지지 않고 있다.
본 논문에서는 이차신호전달물질로 알려진 VDCC와 PKC 유전자의 각 subunit(PKC α, β, γ, ε, δ, ζ 및 VDCC L형, P형, R형, N1형, N2형)의 발현을 흰쥐의 청각뇌간핵에서 in situ hybridization 조직화학법을 이용하여 관찰하고 각 신호전달물질의 조직특이성을 규명하고자 하였다.
재료 및 방법
실험동물 및 절편 제작
몸무게 220~250gm 사이의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 단두한 후 뇌를 적출 하여 절편을 얻는다. 절편을 고정(4% formaldehyde in 1×PBS) 및 탈수(graded ethanol and chloroform)e 시킨 후 in situ hybridization 전까지 -20℃ 또는 -70℃에 보관하였다.
cDNA 합성
흰쥐 대뇌에서 얻은 total RNA를 65℃에서 1 μg의 random primer와 함께 반응시켜 priming한 후 0.5 mM dNTP를 포함한 반응완충액에서 MMLV reverse transcriptase를 가하여 cDNA를 합성하였다.
Oligonucleotide primer 제조
전압의존성 칼슘채널 및 PKC 말단부위를 증폭하기 위해 각 타입에 특이적인 염기서열을 검색한 후 RT PCR로 두 primer를 사용하여 oligonucleotide를 제조하였다.
PCR과 subcloning
cDNA 합성용액 5 μl, 각 타입 특이적인 primer set 10 pmol을 가한 후 Taq polymerase를 이용해 PCR을 시행하였다. PCR 반응은(95℃/5분, 94℃/1분, 50℃/1분, 72℃/2분)씩 총 30 cycle을 polymerization하였다. PCR로 얻은 DNA 20∼50 ng을 T-vector에 ligation 하여 2배 희석한 후 2 μl 취하여 electrocompetent cell에 transformation하고 X-gal이 포함된 LB ampicillin plate에서 키운다. 흰색 colony를 취하여 50 μg/ml ampicillin이 포함된 LB broth에서 키운 후 plasmid를 정제하였다. 이 plasmid 중 insert의 존재여부는 Eco R1으로 절단한 후 1.0% agarose 전기영동 상에서 확인하였다.
In situ hybridization histochemistry 를 위한 riboprobe 제작
PCR을 이용해 얻은 전압의존성 칼슘채널 및 PKC들의 cDNA들을 multicloning site 양끝에 polymerase promotor(SP6, T7)를 갖고 있는 vector에 넣은 후 E.coli에 transformation시켜 증폭시켜 template를 얻었다. 적절한 절단효소를 이용해 template를 펼친(linealization) 후 promotor에 특이적으로 작용하는 RNA polymerase와 35S 표지된 UTP를 이용해 in vitro transcription을 시행해 동위원소가 표지된 riboprobe를 얻었다. 전사반응이 종결된 후 전사체를 정제 및 회수하였다. 얻어진 전사체는 증류수에 용해시켜 일정량을 취한 후 liquid scintillation counting으로써 방사능을 측정하였다.
In situ hybridization 조직화학법
표지된 probe가 함유된 hybridization 완충액(1×10 7 cpm/ml)을 각 slide 당 60 μl씩 점적하고 Tm 값에서 얻은 온도에서 16∼24시간 동안 반응(hybridization)시켰다. Hybridization이 끝나면 37℃에서 30분간 RNase를 처리(20 μg/ml RNase A, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) 하고 SSC로 수세한 후 에탄올로 탈수시킨다. 공기 중에서 말려 β-max Hyperfilm(Amersham U.K.)에 standard slide와 함께 3∼7일간 노출시켜 현상하여 결과를 영상분석기를 이용하여 분석하였다. 이 slide들을 nuclear emulsion 용액인 NTB2 용액에 담근 후 2∼4주간 냉동고에 보관한 다음 D-19으로 현상하여 cresyl violet으로 대조 염색한 후 결과를 암시야 현미경(darkfield microscope)으로 관찰한다.
결과
PKC 유전자의 발현
PKC 유전자는 subunit별로 다양한 발현 분포를 보이고 있다(Table 1). PKC α와 β는 하구핵에서 미약한 발현이 관찰 되었으며 그 외의 청각뇌간핵에서는 발현이 관찰되지 않았다. PKC δ와 γ는 청각뇌간핵중 와우핵에서 현저히 증가된 발현을 보이고 있으며, 상올리브핵과 하구핵에서는 관찰되지 않았다(Fig. 1). PKC ζ는 상올리브핵에서 다른 부위에 비하여 현저히 증가된 발현양상이 관찰되었다(Figs. 2 and 3).
VDCC 유전자의 발현
VDCC는 각각 L, P, R, N1, N2 type으로 나뉘며, 각각의 청각뇌간핵에서의 발현 양상은 다양하게 나타나고 있다. 각 type의 VDCC중 L type이 모든 중추 청각경로에서 관찰되고 있으며, 특히 상올리브핵과 하구핵에서 많은 발현을 보이고 있다(Fig. 4). 그 외 P type은 하구핵에서 R type 은 와우핵과 하구핵에서의 미약한 발현이 관찰되었고, N type은 거의 관찰되지 않았다.
고안
중추청각경로는 와우핵(cochlear nucleus), 상올리브핵(superior olivary nucleus), 하구핵(inferior colliculus), lateral과 medial lemniscus 및 trapezoid body로 구성되어 있으며,7) 복잡한 신경시냅스가 일어나는 부위이다. 이러한 중추청각 신경계는 특이한 기능을 수행하는 다양한 세포 집단으로 구성되어 있으므로 여러 타입의 신호전달물질들의 기능을 이해하기 위하여는 청각경로에서 각 타입의 신호전달물질의 발현 분포를 관찰하는 것이 중요하다. 청각기관에서 이차신호전달물질의 역할에 관하여 Coling 등8)은 와우의 fluid homeostasis 및 유모세포들의 운동, 적응, 신호전달 등에 관여하며 이과적인 질환과 이독성물질에 인한 난청의 병인에 중요한 역할을 할 것이라고 보고하였다. 이차신호전달물질들에 관한 연구는 주로 전기생리적 방법, 리간드결합 방법, northern blot법과 western blot법 등에 의하여 골격근, 심장근육, 신경조직 등에서 이루어져 왔다. 본 논문에서는 in situ hybridization 조직화학법을 이용하여 청각경로에서 이차정보전달계(second messenger system)에 관여하는 물질로 알려진 PKC subunit 유전자와 전압의존성 칼슘채널(VDCC) 유전자의 각 subunit 들의 발현 분포를 관찰하였다. 실험 결과에서 나타난 바와 같이 PKC와 VDCC의 각 subunit간에는 청각뇌간핵에서의 발현 양상에 차이를 보이고 있다. PKC 유전자중 δ와 γ는 와우핵에서, ζ는 위올리브핵에서 특히 많이 발현되었으며 그 외 α, β, ε subunit는 중추 청각계에서의 발현이 거의 되지 않거나 미약하였다. 이와 같은 소견은 각 subunit간에 서로 다른 역할을 하거나 상호 보완 관계를 가지고 정보 전달과정에 관여할 것으로 여겨진다. 즉 δ와 γ는 청각신호전달 과정에서 구심성 시냅스에, ζ는 올리브-와우 원심성 시냅스에 관여할 것으로 생각할 수 있다. PKC의 청각기관에서의 역할에 관하여는 Kitano 등9)은 와우에서의 compound action potential(CAP) 형성하는 기전에 관여할 것이라 하였고, Lerner-Natoli 등10)은 정상 와우에서는 PKC α, β, γ가 일차청각신경세포에 세포체에서 관찰되었으며, 신경독성에 의한 청각 신경 변성후 신경시냅스 부위에서 각 isoform의 발현이 증가하였고 특히 PKC γ가 오랫동안 관찰되어, 신경재생에 관여할 것이라 보고 하였다. 본 연구에서는 와우에서의 PKC 유전자의 발현을 관찰하지 않아서 와우와 중추신경계 사이에서의 역할을 명확히 언급하기는 어렵지만 청각뇌간핵에서 각 subunit간의 특이한 발현 양상은 구심성 및 원심성 신경전달에 있어서 각각 다른 역할을 할 것이라는 것을 시사하고 있다.
VDCC는 세포막에 존재하고 전압변화에 의해 신경세포에서 세포내 칼슘농도 변화에 제일 먼저 관여하는 것으로 알려져 있다.11) VDCC는 전기생리학 및 약리학적으로 L, N, P, Q, R 및 T 타입 등으로 분류된다.12) 이들 중 T-type VDCC은 안정막 전압 상태에서 비교적 낮은 탈분극에 의해 열리는 low voltage activated(LVA) 그룹에 속하며, L, N, P-type은 높은 전압에 의해서 채널이 열리는 high voltage activated(HVA) 그룹에 속한다.13) 청각기관에서는 외유모세포14)와 나선신경절세포15)에서 VDCC의 존재가 확인되었으며 특히 나선신경절에 분포하는 VDCC는 HVA 그룹에 속하는 L type이 작용한다고 하였다. 이러한 VDCC는 세포막에 존재하며 신경세포에서는 활동전압에 의해 신경세포에서 세포내 칼슘농도 변화에 관여하여 칼슘의 유입을 조절하며, 신경 시냅스에서 신경전달물질의 유리에도 역할을 한다.16) 본 연구에서는 높은 전압에서 작용하는 VDCC 중 L type이 와우핵, 상올리브핵 및 하구에서 다른 type에 비하여 현저히 증가된 발현을 관찰할 수 있었으며, P type은 하구에서만 관찰되었고, N type은 청각뇌간핵에서 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과로 보아 청각기관에서는 각 VDCC의 type중 L type이 이차신호전달계에서 작용하고 있다고 여겨진다.
본 연구에서 관찰된 바와 같이 중추청각경로에서 이차신호전달물질이 청각 정보의 전달 과정에서 중요한 역할을 하고 있다는 것을 알 수 있으며, PKC와 VDCC의 각 subunit 상호 간에 서로 다른 역할을 하고 있거나 혹은 서로 보완적인 역할을 하고 있으리라 생각된다. 청각이라는 매우 복잡한 생리적 과정을 이해하기 위하여는 중추청각경로와 함께 말초 청각기관인 와우에서의 발현 양상을 비교 관찰하는 것이 이차신호전달물질의 보다 정확한 역할을 이해하는데 도움이 될 것으로 여겨진다.
REFERENCES
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