Expression of Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Aural Cholesteatoma Measured by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Hu, Jin; Kim, Hyung-Jong; Lim, Hyun-Joon; Cho, Yang-Sun

Original Article

Middle Ear Diseases

Korean Journal of Audiology 2000;4(1):14-20.

Expression of Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Aural Cholesteatoma Measured by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Jin Hu¹, Hyung-Jong Kim¹, Hyun-Joon Lim¹, Yang-Sun Cho²

¹Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery, College of Medicine, Hallym University, Seoul
²Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery, College of Medicine, SungKyunKwan University, Seoul, Korea

중이진주종에서 역전사-중합효소 연쇄반응법으로 측정한 상피성장인자 수용체 유전자의 발현

허진^¹^, 김형종^¹^, 임현준^¹^, 조양선^²

^¹한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
^²성균관대학교 의과대학 이비인후과학교실

Abstract

Aural cholesteatoma is characterized by the presence of keratinizing squamous epithelium in the middle ear. Bone destruction of adjacent structures is mainly responsible for serious intracranial complications in this disease. Previous studies suggested that expressions of epidermal growth factor and its receptor were overexpressed in cholesteatoma epithelium, compared with normal skin. The purpose of this study was to investigate the role of epidermal growth factor receptor (EGFR) in proliferation and progression of middle ear cholesteatoma by measuring the extent of EGFR gene expression. In cholesteatoma and normal skin, mRNA of EGFR was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Each measurement of EGFR mRNA was perfomed in cholesteatoma and normal skin by semiquantitative image analysis (densitometric analysis) compared with that of GAPDH. EGFR gene was expressed in all ten cases of cholesteatoma, where the value of measured EGFR compared with GAPDH (EGFR/GAPDH ratio) was 0.27＋0.12. In normal skin, EGFR gene was expressed in all five cases, and the EGFR/GAPDH ratio was 0.12＋0.08. It indicated that EGFR gene was expressed significantly higher in choleateatoma than normal skin (p<0.05). Using RT-PCR, increased expression of EGFR gene was demonstrated in cholesteatoma suggesting an important role in the pathogenesis of the disease.

Keywords: Cholesteatoma;RT-PCR;EGFR.

교신저자：김형종, 431-070 경기도 안양시 동안구 평촌동 896
전화) (031) 380-3840, 전송) (031) 386-3860, E-mail) hjk1000@www.hallym.or.kr

서 론

중이 진주종은 각화성 편평상피가 중이강에 비정상적으로 존재하는 것으로 정의된다. 골 조직을 포함하여 주위 구조물을 파괴하는 임상적 특징 때문에 중이 진주종의 발생 및 골 파괴 기전을 규명하려는 연구가 꾸준히 진행되어 왔다. 그 발생기전으로는 태생기때 남아 있던 편평 상피에서 발생한다는 선천성 설,¹⁾ 천공된 고막 혹은 상고실의 함몰을 통해 유입된 외이도나 고막의 상피에서 발생한다는 상피이동 설,²⁾ 그리고 중이점막이 각화성 편평상피로 화생한다는 화생 설³⁾ 등 여러 가설이 제기되었으나 각화성 편평상피가 성장 특성을 변화시키고 과증식을 초래함으로써 진주종을 형성한다는 점에서는 의견이 일치하고 있다.
최근 면역학, 유전학 및 분자생물학의 발달에 힘입어 진주종 상피의 증식능을 측정하려는 연구가 활발히 진행되었고 진주종 상피의 과증식 성향과 여러 성장인자 및 그 수용체와의 연관성이 밝혀졌다.⁴⁾ 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, 이하 EGFR)는 분자량 170 kDa의 인당단백으로 상피성장인자와 결합하게 되면 그 수용체의 자가인산화가 일어나고 여러 표적 단백의 인산화 등 일련의 생화학적 반응으로 이어져 결과적으로 DNA의 생성및 세포의 증식이 일어나게 된다.¹⁾ 또한, 세포질내 부분의 EGFR과 υ-erb-B transforming oncogene 단백질 사이에 유사성이 있음이 밝혀짐에 따라¹⁾⁵⁾ 정상 및 비정상 세포의 성장을 조절하는데 중요한 역할을 하는 EGFR이 진주종 상피의 과증식에도 깊은 연관이 있을 것으로 생각하고 있다.⁶⁾
중이 진주종 상피의 과증식에서 EGFR의 역할은 국내외적으로 면역조직화학적, 면역세포학적, 분자생물학적 방법을 이용한 연구를 통하여 그 연관성이 증명되고 있지만 중합효소 연쇄반응을 이용하여 중이 진주종에서 EGFR의 유전자의 발현을 정량적으로 시도하였던 연구는 드물다. 김 등⁷⁾에 의하면 면역조직화학적 염색과 밀도 측정기 분석을 통한 반정량적 연구에서 타 연구의 결과와 달리 중이 진주종 상피와 정상 상피간에 EGFR 단백의 발현정도는 차이가 없었다고 하였으나 배양된 각질세포의 유세포 계측법을 통한 정량적 연구에서 EGFR 단백의 발현이 중이 진주종에서 정상보다 높고 편평상피암보다는 낮다고 보고하였다.⁸⁾ 이러한 상반된 결과는 중이 진주종 연구에서 이전에 보고된 EGFR 단백의 과발현은 결과 판독상에 오류의 가능성을 배제할 수 없다는 점을 시사하고 있다. 중이 진주종에서 EGFR mRNA를 in situ hybridization법으로 관찰하여 정상보다 발현이 증가하였다고 보고한 바 있으나⁶⁾ 정량적으로 측정하지는 못하였다. 정상서도 발현되는 EGFR이 중이 진주종의 발생기전에 관여함을 증명하기 위해서는 결과 생성물인 EGFR 단백 보다는 체내에서 EGFR 단백의 증감을 조절하는 유전자의 발현을 관찰하여야 하고, 동시에 보다 정량적으로 정상보다 증가했다는 측정 결과가 필요할 것으로 생각된다.
본 연구실의 중이 진주종에서 EGFR의 발현에 대한 일련의 연구로서 이번 연구의 목적은 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, 이하 RT-PCR)법을 이용하여 반정량적으로 EGFR mRNA를 측정함으로써 진주종과 정상 상피간에 EGFR 유전자 발현의 차이 유무를 확인하고, 진주종 증식에 EGFR이 관여하는 지를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

연구재료

연구대상은 중이 진주종으로 진단받고 중이 근치술을 시행받은 예를 대상으로 하였다. 수술시 채취한 중이 진주종 조직 중 표본 상태가 좋은 10예를 실험군으로 하였고, 이 중 5례를 선택하여 이개부의 정상 피부조직을 함께 채취하여 대조군으로 이용하였으며, 두경부에서 발생한 편평상피암 조직 2예를 EGFR mRNA 실험의 양성 대조군으로 하였다. 조직 내 mRNA의 파괴를 막기 위하여 채취 후 즉시 -160°C 액화질소에 보관하였다가 필요시 꺼내어 사용하였다. 채취한 조직 중 일부는 H&E 염색을 통하여 광학현미경으로 조직을 확인하였고, 나머지는 해부현미경하에서 상피 조직 만을 분리하여 이것을 RT-PCR의 재료로 이용하였다.

연구방법

조직으로부터 total RNA의 추출
냉동 보관된 조직 중 일부(50~100 mg)를 잘라서 해부 현미경하에서 상피조직만을 분리하여 분쇄기로 잘게 부수고, TRIzol^® reagent(Life technologies, USA) 1 ml에 넣어 상온에서 5분간 방치하여 조직을 분해하였다. RNA를 추출하기 위하여 chlorform 200 μl를 넣고 잘 섞은 뒤 2분간 상온에 방치하였고 다시 4°C, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 RNA가 녹아있는 상층액 만을 분리하였다. 이 상층액에 isopropanol 0.5 ml를 넣고 10분간 상온에 방치한 후 4°C, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 바닥의 RNA pellet 만을 얻었다. 이것에 75% ethanol 0.5 ml를 넣고 다시 4°C, 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액은 버리고 남은 RNA pellet을 공기에 건조시켰다. 이 RNA pellet을 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate) 50 μl를 넣고 녹여서 조직에서 추출한 total RNA를 준비하였다. 그 중 일부는 spectrophotometer로 260 nm에서 농도를 측정하였고, 일부는 전기영동하여 얻어진 RNA가 파괴되지 않고 온전한 형태인지 확인한 뒤 역전사의 재료로 사용하였다.

cDNA의 제작
추출한 total RNA를 65°C에서 10분간 가열한 후 역전사 혼합물과 잘 섞어 42°C에서 60분간 반응하여 cDNA를 얻었고, 95°C에서 5분간 반응하여 여분의 AMV reverse transcriptase(이하 AMV-RT)를 불활성화시켰다. 역전사 혼합물의 구성 성분과 용량은 random hexaprimer(500 μg/ml) 1 μl, extracted total RNA 1~5 μg, distilled water 12 μl, 5X first strand buffer 4 μl, dNTP mix(10 mM) 1 μl로서, 총량은 20 μl이었다.

Oligonucleotide primer
EGFR sense primer는 사람의 EGFR mRNA중 3856째 염기서열에서 시작하여 30개의 염기서열을 갖는 RNA에 상보적인 염기서열을 갖는 oligonucleotide를 선택하였고, EGFR anti-sense primer는 사람 EGFR mRNA중 4058째 염기서열에서 시작하여 27개의 염기서열을 갖는 RNA에 상보적인 구조를 갖고 있는 oligonucleotide를 선택하였다(Table 1). 이 부분이 선택된 이유는 사람과 mouse의 EGFR cDNA 염기배열에서도 이 부분이 동일한 구조를 갖고 있어서 매우 잘 보존되는 부분으로 생각되고 EGFR mRNA의 PCR반응에 특이적이라고 알려졌기 때문이다.⁸⁾ 이 oligonucleotide primer를 이용하여 PCR을 시행하였을 때, 염기 202쌍의 크기를 갖는 EGFR cDNA가 합성된다. House keeping gene으로서 glycealdehyde 3-p-dehydrogenase(이하 GAPDH)를 사용하였고, GAPDH의 PCR 산물은 540 염기쌍의 크기를 갖는다.

중합효소 연쇄반응
미리 만들어진 cDNA와 PCR 혼합물를 섞은뒤 뒤 동량의 mineral oil로 상층을 덮고 PCR machine(Perkin Elmer 9600)을 이용하여 cDNA를 증폭하였다. PCR혼합물의 구성성분과 용량은 PCR CORE KIT (BoeringerManheim, Germany)에서 제공하는 재료와 방법을 이용하여서 다음과 같이 이용하였다. 10X PCR buffer 5.0 μl, dNTP(10 mM) 1 μl, sense primer(20 mM) 0.5 μl, anti-sense primer(20 mM) 0.5 μl, Taq polymerase(5 unit/μl) 0.5 μl, cDNA(100 ng/μl) 2 μl, distilled water 37.5 μl로서, 총 양은 50 μl였다.
반정량적 PCR을 위해서 PCR반응에 넣어주는 cD-NA의 양을 조절하였으며, 이는 역전사 반응 후 얻은 cDNA를 1, 1：5, 1：10, 1：20, 1：50, 1：100의 비율로 희석하여 각각의 농도에 대해 PCR을 시행한 뒤 이것을 전기영동하고 측정하였다. cDNA가 1：5에서 1：50의 비율의 구간에서 PCR산물의 농도가 cDNA에 대하여 대수적 비례관계를 보였고 이중 농도가 높은 1：10의 희석농도상태로 cDNA를 희석하여 PCR에 이용하였다. 중합효소 연쇄반응의 온도와 시간조건은 PCR CORE KIT^®(BoeringerManheim, Germany)에서 제공하는 조건을 따랐으며, 자세한 내용은 다음과 같다. 총 34 cycle을 시행하였고 1 cycle은 94°C 3분, 2 cycle부터 33 cycle까지는 94°C 1분(denaturation), 53°C 1분(annealing), 72°C 1분(elogation)을 반복하였으며 34 cycle은 72°C에서 7분간 반응시켰다.

PCR 산물의 반정량적 측정
   PCR반응산물 15 μl를 loading dye와 섞은 뒤, size marker와 함께 2% agarose gel에 싣고, 100V에서 약 20분간 전기영동한 뒤, 자외선하에서 band의 위치를 확인하였다. 또한 densitometer(VILBER LOURMAT)와 Bio-profil^® image analysis software(ver. 97)를 이용하여 이 gel에서 EGFR과 GAPDH의 band의 밝기를 계측한 뒤, GAPDH band에 대한 EGFR band의 밝기의 비(EGFR/GAPDH)를 계산하였다. 중이 진주종과 정상 상피(Fig. 1), 그리고 편평 상피암(Fig. 2) 조직에서 EGFR/GAPDH의 값을 비교하였다. 통계학적 검정을 위하여 SPSS for windows(release 7.5.1)를 이용하여 t-test를 시행하였다(p<0.05).

결     과

조직에서 추출한 RNA의 확인

조직에서 추출한 RNA를 loading dye와 함께 1% agarose gel에 걸고 전기영동하였으며, 이때 추출한 RNA가 깨어지지 않고 온전한 형태인 경우 18S와 28S에 선명한 band를 확인할 수 있었고, 그렇지 못한 경우에는 RNA 추출이 완벽하지 못한 것으로 생각하여, 추출을 다시 시행하였다.

자외선하에서 RT-PCR 산물의 관찰

자외선하에서 EGFR band가 202 bp에 선명하게 나오는 경우를 EGFR 발현 양성으로 하고 발현이 없거나 다른 위치에 발현되는 경우를 음성으로 하였다. 중이 진주종 10례 모두에서 EGFR 양성반응을 보였으며, 정상 상피 5례와 편평 상피암 2례에서도 모두 EGFR 양성반응을 보였다.

RT-PCR 산물의 반정량적 측정

반정량적인 측정을 위하여 편평 상피암과 중이 진주종 상피 및 정상 상피에서 202 bp의 EGFR의 band와 540 bp의 GAPDH의 band의 density를 densitometer로 각각 계측하였고, 그 상대적인 비로서 비교하였다(Table 2). GAPDH에 대한 EGFR의 발현비율은 진주종에서 0.27±0.12로 정상의 0.12±0.08보다 통계학적으로 유의하게 높았고(p<0.05), 양성 대조군인 편평 상피암의 값 0.42보다는 낮게 측정되었다.

고     찰

최근 연구에 의하면 중이 진주종의 발생과 골 파괴 기전에 여러 성장인자들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 진주종 상피에서 tumor necrosis factor-alpha,¹⁰⁾ epidermal growth factor(EGF),⁶⁾ transforming growth factor-alpha,⁴⁾¹¹⁾ transforming growth factor-beta, Ki-67¹²⁾¹³⁾ 및 interleukin-1¹⁴⁾ 등이 증가하며, 중이 진주종에서 이러한 cytokine의 발현을 관찰함으로써 진주종 상피의 세포증식을 특징으로 하는 중이 진주종의 발생 및 진행을 설명하는 것이 최근 추세이다.
신경성장인자를 연구하는 과정에서 생쥐의 악하선에서 처음으로 분리하여 보고된 EGF¹⁵⁾는 정상세포의 증식과 분화에 관여하는 분자량 6045 dalton의 폴리펩타이드 단백으로 세포막에 있는 수용체인 EGFR과 결합함으로써 그 신호를 세포내로 전달하여 세포의 이온교환을 일으킨다.¹⁰⁾¹⁶⁾
EGFR은 170 kilodalton의 당단백으로 세포표면에 위치하며, 그 구조는 1) 성장인자와 결합하는 extracellular ligand-bind domain, 2) 세포막을 관통하는 짧은 transcellular hydrophobic domain, 3) 수용체와 결합된 신호의 세포내로의 전달을 맡는 intracellular tyrosine-kinase domain으로 구성되어 있다.¹⁾ EGFR의 extracellular domain에 EGF가 결합되면 수용체 분자의 입체적 구조의 변화가 초래되며 intracellular domain의 기능인 tyrosine kinase가 활성화되고, 세포내의 inositol triphosphate, cAMP, diacrylglycerol 및 calcium channel 등 second massenger가 관여하게 되고, 이어서 protein kinase C, phospholipase C, G protein, adenylate cyclase 등 연속적 활성화에 의하여 ion 균형의 변화, 세포 골격의 재배열, 막지질의 변화, 단백 합성능력의 변화 등 일련의 생화학적 반응으로 이어지고 결과적으로 DNA 생성과 세포의 증식이 일어나는 것으로 알려져 있다.¹⁾¹⁷⁾ 또한, EGFR은 세포의 분화와 호르몬 분비에 관여하며, transforming growth factor-α의 수용체로도 작용한다.¹⁸⁾ 과발현된 EGFR은 EGF없이도 수용체의 활성도를 일정하게 유지하는데 그 이유는 EGFR의 세포막외 부분을 제외한 세포막 및 세포막내 부분이 avian erythroblastosis virus의 υ-erb-B 암유전자의 단백산물과 유사한 구조를 가지는 sequencing homology가 있어 이 부위가 tyrosine kinase에 영향을 미쳐 그 활성도를 지속시킴으로써 EGFR이 정상 및 비정상 세포의 증식을 촉진하는 역할을 한다고 설명한다.¹⁹⁾
중이 진주종의 발생에서 EGFR의 역할에 대한 초기의 연구로서, 동결 절편조직에서 면역조직화학염색법을 사용하여 EGFR이 진주종군의 상피전층 혹은 기저층 및 기저 직상부층에서 강한 양성이 나타남을 보고하였고,⁴⁾ 40bp의 biotin-labelled DNA probe를 이용한 EGFR mRNA in situ hybridization을 통해 진주종 상피전층에서 강한 양성반응을 관찰함으로써 진주종의 발생 기전에서 EGFR 유전자의 과발현이 중요한 요인이라고 주장하였다.⁶⁾
그러나 국내의 다른 연구에서 면역조직화학적 방법으로 진주종 상피에서 EGFR의 발현을 관찰하였을 때 그 정도가 정상 피부보다 유의하게 높지 않았으나,⁷⁾ 유세포 계측법을 이용한 검사에서는 진주종 상피에서 EGFR의 발현이 유의하게 높았다고 하여⁹⁾ 진주종에서 EGFR의 발현의 정도에 관해 타 논문과 비교하여 상충된 결과를 제시하였다. 동 저자는 중이 진주종에서 EFGR의 발현정도를 규명하기 위해 보다 정량적 계측방법이 필요하다고 사료된다.
저자들은 중이 진주종 발생에서 EGFR의 역할을 고찰하기 위한 일련의 연구로서 반정량적 RT-PCR법을 이용한 본 연구를 시행하였다. 본 연구의 결과로서 정상에 비해 진주종에서 EGFR 유전자의 과발현됨을 관찰할 수 있었고 이 결과는 이전의 연구 결과⁷⁾⁹⁾와 함께 진주종의 발생 기전에서 EGFR의 역할을 확증하는 의미가 있으며 특히, 상피 과증식과 관련이 있음을 추측할 수 있게 한다. 그러나, 실험 방법에 따라 결과를 달리 할 수 있음을 제시한 이전의 결론을 간과해서는 안되며 특히, 조직 질환의 병리 기전에서 cytokine의 역할을 규명하기 위한 연구는 단일 방법을 통한 결과에 의한 결론은 주의해야 한다는 지적을 할 수 있겠다.
본 연구에서 얻은 결과도 중이 진주종에서 EGFR 단백 산물의 과발현이 관찰되지 않았다는 연구와 함께 고려하면, 중이 진주종에서 EGFR의 발현에 대한 연구는 한가지 방법으로 그 결과를 해석하는 데는 오류의 가능성이 있고, 또 여러 실험 방법들이 각각의 장점과 단점을 가지고 있으므로, 객관적이고 정량적인 방법을 선택하는 것이 필요하고, 여러 실험방법을 사용한 결과를 종합적으로 고려하여야 할 것으로 생각된다.
반정량적 RT-PCR법을 이용한 EGFR의 검출은 민감도가 높아 역전사 과정을 통하여 적은 수의 mRNA도 확인할 수 있고, house keeping gene과의 비교 분석에 의해서 목적하는 유전자의 발현을 어느 정도 정량적 계측이 가능하다는 장점이 있다. 하지만 RNA의 추출 과정시 RNA가 손상받기 쉽고, 민감도가 높아 위양성의 가능성이 높아 실험실 조건 확립 등에 주의를 기울여야 한다. 또한, RT-PCR법은 반응이 충분히 진행되었을 경우는 초기의 주형(template)량과 지수 비례적 증폭산물이 생기므로 원래의 주형량을 추정하기는 어렵다. 다만, 대수 비례적으로 생성물이 증가하는 구간을 선택하여 그 template 농도에서 PCR 조건을 설정하고 증폭을 시행하면 초기 주형량의 추정이 어느 정도 가능하다. 본 연구에서는 역전사 반응에 의한 초기 cDNA를 1, 1：5, 1：10, 1：20, 1：50, 1：100의 비율로 희석하고 각각에서 PCR을 실행하여 희석비율과 densitometry로 측정한 PCR 산물의 양의 관계를 구하고 cDNA의 농도에 따른 PCR 산물의 농도가 대수적 비례 관계를 보이는 구간의 비율로 cDNA를 희석하였고 그 농도하에서 반정량적 PCR의 조건을 확립하여 사용하였다. 이번 연구에서 얻은 결과는 부분적인 실험 조건의 내적 문제로 인해 target gene에 대한 정량적 분석이라고 하기는 어렵다. 그러나 house keeping gene을 internal control로 한 반정량적 측정의 결과라 할 수 있고 동 연구실에서의 일련의 연구 결과와 비교한다는 의미가 있다. 본 연구실에서는 앞으로 중이 진주종에서 EGFR의 역할규명에 관하여 in situ hybridization법을 이용한 연구와 보다 정량적인 competitive inhibitor gene을 이용한 RT-PCR법을 통한 추가 연구를 계획하고 있다.
본 연구에서 진주종 상피에서 EGFR mRNA의 발현에 개체간에 차이가 나타난 것은 진주종의 상피 증식이 EGFR뿐만 아니라 interleukin, cytokeratin 그리고 다른 성장인자 들과 함께 아직 밝혀지지 않은 여러 인자의 복합적인 영향을 받고 있음을 암시해 준다. 그러므로 EGFR 이외의 cytokines이나 그 유전자에 대한 검색이 동일한 batch에서 동시에 시행될 수 있으면 진주종 상피 증식의 원인에 관한 확실한 단서를 찾을 수 있을 것이다.

결     론

본 연구에서는 각질세포의 과증식을 특징으로 하는 중이 진주종에서 EGFR의 발현양상을 반정량적 역전사 중합효소반응을 통하여 정상 피부조직과 비교하여 다음의 결과를 얻었다.
중이진주종에서는 전 예 모두 EGFR mRNA의 발현이 양성으로 나타났으며, 발현의 정도는 EGFR/GAPDH 값이 중이 진주종에서 정상보다 유의하게 높게 측정되었다.
이러한 연구결과는 EGFR이 진주종의 발생 기전에 관여하고 있으며, 특히, 진주종 상피의 과증식에 관련이 있을 것임을 시사한다.

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