Mitochondrial DNA 4977 bp Deletion Associated with Presbycusis

Choi, Ick Soo; Jun, Byung Hoon; Lee, Baek Rak

Original Article

Genetics

Korean Journal of Audiology 2001;5(2):98-104.

Mitochondrial DNA 4977 bp Deletion Associated with Presbycusis

Ick Soo Choi¹, Byung Hoon Jun¹, Baek Rak Lee²

¹Department of Otolaryngology, Inje University College of Medicine, Seoul Paik Hospital
²School of Biomedical science Biotechnology, Institute of molecular biology, Seoul, Korea

노인성 난청 환자에서 Mitochondria DNA의 4977 bp 결손변이

최익수^¹^, 전병훈^¹^, 이백락^²

^¹인제대학교 의과대학 서울백병원 이비인후과학교실
^²의생명공학대학 생명공학부 및 분자생물학 연구소

Abstract

Objects：Acquired mitochondrial DNA (mtDNA) defects have been proposed as important determinants of aging and various degenerative disease. mtDNA4977 deletion has been found to be associated with many mitochondrial disease and aged tissues. There is a preliminary report that this mutation is more frequent in the temporal bone of patients with presbycusis than in age matched controls. However it is possible that the distinct types of presbycusis may have different deletion rates. This study was designed to determine if the mutation is associated with presbycusis and deletion rates are different in each types of presbycusis patients by examining human leukocytes.

Methods：This study examined mtDNA isolated from peripheral blood leukocytes -29 patients with presbycusis divided 5 types by shapes of audiogram and 152 normal control subjects older than 50 years. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the base pair products that correspond to targeted gene region. Two pairs of primers, one is specific for the deletion type and the other one is for wild type were used for PCR. The amplified fragments were separated by electrophoresis in a 2% agarose gel and some of the PCR products were sequenced to confirm the PCR results.

Results：mtDNA4977 deletion was not identified in any of patients with presbycusis or control subjects.

Conclusions：We found that mtDNA4977 deletion is not associated with presbycusis in Korean. But the possibility that the result may be responsible for tissue specificity would be studied later.

Keywords: Presbycusis;Leukocyte;Mitochondrial DNA;Deletion mutation.

교신저자：최익수, 100-032 서울 중구 저동 2가 85번지
전화) (02) 2270-0070~2, 전송) (02) 2270-0073, E-mail：cisoo99@yahoo.co.kr

서 론

노인성 난청의 발병 원인에는 식생활, 소음, 고혈압, 고지혈증 등의 외부적 요인 등이 알려져 있으며, 개인에 따라 매우 큰 차이가 있으므로 유전적 요인과 같은 내부적 요인이 관여할 것으로 추정되나 그 정확한 기전은 알려져 있지 않다.
최근에 노화와 감각신경성 난청을 비롯한 퇴행성 질환의 원인으로써 마이토콘드리아 DNA(mtDNA)의 돌연변이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 사람의 mtDNA는 16,568 base pair(bp)로 구성된 원형의 이중나선 DNA 구조로 12S, 16S ribosomal RNA(rRNA), 22개의 transfer RNA(tRNA)와 호흡고리를 구성하는 13개의 단백질을 encode하는 유전자로 구성되어 있다.¹⁾ mitochondria는 세포 내 energy의 주요 공급원인 adenosine triphosphate(ATP) 생성과정에서 산화적 인산화 반응에 필요한 DNA 유전자를 함유하며 뇌, 평활근, 신장, 간, 취장 islet의 일차적 에너지원 역할을 한다. 체세포는 수천 카피의 mtDNA를 가지고 있으나 그 수는 세포의 종류에 따라 매우 큰 차이가 있는데, 높은 산화적 인산화 과정을 요하는 뇌세포와 근육세포가 특히 많은 양을 함유하고 있다. 산화적 인산화 반응은 cyanide, sodium azide, dinitrophenol 등의 호흡억제제나 decoupler에 의한 만성 중독에 의해 시신경 위축, 난청, 운동실조증, 간질, 운동장애 등을 야기하는 것으로 알려져 있다.²⁾ 최근에 이렇게 변이된 mtDNA가 정상인의 여러 조직에서도 아주 적은 비율이지만 존재한다는 사실이 polymerase chain reaction (PCR)의 방법으로 확인되었다.²⁾ 더욱이 oxydation에 의한 mtDNA의 손상이 축적되고 변이된 유전자의 양이 나이의 증가와 더불어 세포 내에 증가한다는 것이 밝혀졌다. 대략 전체 mtDNA의 0.1%가 손실되었거나 변형된 부분을 갖고 있는데 이것이 전체 mtDNA의 5~10%까지 축적되면 mitochondria의 기능이 상실되고 따라서 질병을 초래하게 된다.³⁾ mtDNA는 핵 유전자에 비해 매우 단순하고 DNA repair 기작이 결핍되어 돌연변이가 쉽게 유도되고 고정되며,⁴⁾ 이로 인해 퇴행성 질환인 파킨슨씨 병, 치매, 헌팅톤씨 병 등이 발병함이 밝혀졌고, 모계 유전성 당뇨병 type II와 암의 진행에도 관련이 있을 것으로 알려져 있으며, 뇌와 심장에서 노화가 진행할수록 5 kb와 7.4 kb 결손 변이가 증가되는 것이 보고된 바 있다.
mtDNA는 난자에 많은 양(100,000/oocyte)이 함유되어 있으나 정자에는 수천 정도의 적은 양이 존재하고, 수정시 정자의 꼬리 시작부위에 위치하는 관계로 수정란에 전달되지 않아 모성 유전(maternally-inherited)된다. 정상인에서 mtDNA 분자의 99.9% 정도까지도 동일하나(homoplasmy), 새로운 변이가 발생하게 되면 두 가지의 표현형을 가지게 되고(heteroplasmy), 이 변이가 고착화되면 지속적으로 증식하여 다시 변이형의 DNA로 homoplasmy 상태를 유지한다.
1988년 이후 특정 증후군이나 질환에 관한 mtDNA 변이의 연구 결과로 Kearns-Sayre syndrome(KSS)이 4977 bp 결손 변이와 관련되며,⁵⁾ myoclonic epilepsy와 ragged red fiber(MERRF)를 갖는 환자에서 mtDNA의 tRNALys 유전자의 nucleotide 8344 부위의 결손변이와 염기치환 변이(substitution mutation)가 발견되었다.⁶⁾ 청력 소실과 관련된 특정 변이에 대한 여러 연구도 이루어져 aminoglycoside에 이독성을 보이는 환자에서 mtDNA의 1,555번 염기가 A에서 G로 바뀐 염기치환 변이가 보고되었고,⁷⁾ 3243 A→G 염기치환 변이에 의한 MELAS(Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episode) 환자에서 감각신경성 난청이 발생하는 것이 알려졌다.⁸⁾ Oshima 등은 원인불명의 감각신경성 난청 환자에서 3243 A→G 염기치환 변이를 발견하고 청력도 유형분석을 통해 와우의 mtDNA 손상에 의한 것으로 추정하였다.⁹⁾ Fischel-Ghodsian 등은 노인성 난청 환자의 내이 조직에서 mtDNA의 cytochrome oxidase II gene mutation¹⁰⁾을 보고하였다.
mtDNA 돌연변이는 missenense, biogenesis, insertion-deletion, copy number 변이로 크게 나눌 수 있는데, 4977 bp 결손 변이는 8470과 13477 위치의 13 bp direct repeat 부위에서 발생하며,¹¹⁾ 전체 결손 변이의 약 30~50%로 가장 많아 'common deletion’이라 칭해진다. 이 부분의 DNA는 전자전달계의 cytochrome c oxidase와 NADH-coenzyme Q oxidoreductase, ATPase 등을 구성하는 단백질을 encode 하므로, 이 부분이 결손된 mtDNA가 계속 축적되면 전자전달에 의한 ATP 합성 기능에 치명적인 손상을 야기하여 일반적인 노화나 mitochondrial encephalomyophathy에서 관찰된다.²⁾ 이 부위는 쥐의 4834 bp에 해당하며 결손 변이가 발생하면 쥐와 사람에서 노인성 난청의 원인이 될 것으로 Seidman은 추정하였다.¹²⁾¹³⁾ Bai 등은 노인성 난청이 있었던 사람의 측두골에서 4977 bp 결손 변이가 17례 중 14례가 있음을 보고하고, 노인성 난청의 병리학적 유형에 따라 mtDNA 변이 발생에 차이가 있을 것으로 추정한 바 있으며,¹⁴⁾ Ueda 등은 감각신경성 난청 환자의 백혈구에서 4977 bp 결손 변이가 유의하게 많으나 연령에 따른 차이는 없었다고 보고한 바 있다.¹⁵⁾
본 연구는 난청과 가장 관련이 있을 것으로 생각되는 4977 bp 결손 변이에 중점을 두어 노인성 난청의 유형과의 관련성을 백혈구의 mtDNA 검사로 증명하고자 하였다.

대상 및 방법

대 상

1998월 4월에서 1999년 5월까지 인제대학교 서울백병원 이비인후과 외래 환자와 노인검진 대상자 및 건강관리 센터에서 검진을 받은 50세 이상의 노인 중 29명의 대상군과 152명의 대조군을 선정하였다. 대상군과 대조군 선정 과정에서 이과적 질환과 난청의 가족력이 있는 경우와 고혈압, 당뇨 등의 전신질환이 동반된 경우는 제외하였다. 노인성 난청의 환자의 청력기준은 Katsarkas가 제시한 기준을 적용하였고(Table 1)¹⁶⁾ 대조군은 청력 역치가 25 dBHL 이하로 선정하였다.

혈액에서 DNA 순수분리

700 μl의 혈액을 해동시킨 후 Eppendorf centrifuge에서 14 Krpm으로 1분간 원심분리하여 침전시킨 후 pellet을 900 μl ACE 용액에 녹여 rotamix에서 10분간 흔들어 침전물을 완전히 녹였다. 1분 동안 동일한 조건으로 원심분리한 후 다시 침전물을 300 μl nuclei lysis 용액을 넣고 손가락으로 강하게 30회 정도 흔들어 침전물을 완전히 녹였다. 이 용액에 20 μl 10% SDS와 6 μl protease K(20 mg/μl)를 섞은 후 56°C에서 2시간 동안 반응시켰다. 여기에 saturated NaCl 100 μl를 섞은 후 15초간 vortexing 시켜 실험대에 5분간 방치하였다. 1분간 동일한 조건으로 원심분리한 후 상등액을 조심스럽게 new tube에 옮긴 다음 2배 부피의 100% alcohol을 첨가하여 손가락 사이에서 가볍게 10회 흔들었다. 이때 형성되는 가는 실 모양의 DNA를 멸균된 needle을 이용하여 100 μl TE 용액이 들어있는 new tube에 옮겨 잘 섞은 후 하루밤 동안 56°C에서 반응시켰다. 260 nm와 280 nm의 흡광도를 측정하였고, 평균적으로 100μg의 DNA를 분리 정제할 수 있었으며, 1% agarose gel 전기영동으로 DNA를 확인하였다.

PCR(Polymerase chain reaction)

미토콘드리아 특정부위의 4,977 bp가 결손된 부위를 검출하기 위하여 PCR primer-1(5’-ATT CCC CTA AAA ATC TTT GAA AT-3’), primer-2(5’-AGA GTA ATA GAT AGG GCT CAG GCG-3’)를, 결손 되지 않은 부위를 검출하기 위하여 PCR primer-3(5’-AGG CGC TAT CAC CAC TCT GTT CG-3’), primer-4(5’-AAT AGG CTT CCG GCT GCC AG-3’)를 합성하였다(고마 바이오텍에서 합성하였다)(Fig. 1). 각각의 PCR 반응은 primer 농도와, MgCl2 농도, 그리고 annealing 온도를 변화시켜 최적의 조건을 확립하였다.

결손된 부위의 PCR
primer-1, 2를 이용하여 결손된 부위를 좌우 횡단하는 373 bp를 증폭하였으며 이때 사용된 조건은 500 μl의 PCR 반응 tube 안에 10X Buffer, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, primer-1, 2를 각각 10pmol, Taq polymerase 0.5unit, mtDNA 100ng을 첨가한 후 mineral oil을 한 방울 떨어뜨린 후 PCR 반응을 시작시켰다. 94°C에서 3분간 초기 변성시킨 후, 94°C에서 1분, 55°C에서 1분, 72°C에서 2분의 cycle을 총 30 cycle 진행시킨 후, 마지막으로 72°C에서 10분 동안 증폭시켰다.

결손 되지 않은 부위의 PCR
primer-3, 4를 이용하여 결손 되지 않은 부위를 좌우 횡단하는 549 bp를 증폭하였으며 이때 사용된 조건은 500 μl의 PCR 반응 tube 안에 10X Buffer, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, primer-1, 2를 각각 10 pmol, Taq polymerase 0.5unit, 미토콘드리아 DNA를 100 ng을 첨가한 후 mineral oil을 한 방울 떨어뜨린 후 PCR 반응을 시작시켰다. 94°C에서 3분간 초기 변성시킨 후, 94°C에서 1분, 66°C에서 1분, 72°C에서 2분의 cycle을 총 30 cycle 진행시킨 후, 마지막으로 72°C에서 10분 동안 증폭시켰다.

전기영동

Agarose gel 전기영동은 Maniatis¹⁷⁾ 등의 방법에 준하여 실행하였다. 각각의 증폭된 부위를 확인하기 위하여 2% agarose gel을 만든 후 0.5X TBE buffer에서 150V로 2시간 동안 전기영동한 후 0.5 μg/ml의 Ethidium Bromide(EtBr) 용액에 20분간 염색을 하고 2분간 물로 씻어 longwave length UV light를 조사하여 DNA band를 조사하였다.

Sequencing

결손 되지 않은 부위를 증폭한 PCR 산물을 plasmid vector pUC57/T(MBI Fermentas)에 subclone 하였다. plasmid DNA를 정제하여 Li-Cor 사의 자동 염기 분석기로 sequencing 하였다(Bionex Inc. Korea).

결     과

29명의 환자군에서 남자는 16명, 여자는 13명이었으며, 평균 연령은 69세였다. 청력도 유형에 의한 노인성 난청의 유형은 감각성 3명, 신경성 5명, 대사성 5명, 와우전도성 10명, 혼합성 6명의 결과를 보였다. 152명의 대조군 중 남성은 128명 여성은 31명이었으며, 평균 연령은 58세였다.
노인성 난청이 있는 환자 29례와 152례의 정상대조군의 미토콘드리아 DNA에서 primer-1, 2를 이용한 PCR 산물은 모두 단일 띠로 증폭되지 않았다(Fig. 2). primer-3, 4를 이용한 PCR 산물은 모두 예측한 크기의 선명한 띠로 증폭되는 결과를 보여(Fig. 3) 환자군과 대조군의 차이가 없었다. 그러므로 환자군에서 노인성 난청 유형별 변이 발생률의 차이를 구할 수 없었다.
primer-3, 4를 이용한 PCR 산물의 sequencing 결과 미토콘드리아 DNA와 완전히 일치하였다.

고     찰

본 연구 결과 대상군과 대조군 모두 mtDNA 4977 bp의 결손 변이를 발견할 수 없었으며, 따라서 난청 유형에 따른 결손 변이 발생률 차이를 알 수 없었다. 또한 152례의 많은 대조군 중 변이가 전혀 나타나지 않은 점은 이 결손 변이가 노화와 더불어 증가하며 노인성 난청의 원인일 것이라는 가설과 완전히 상이한 결과를 보이는 것으로, 다음과 같은 2가지 점을 재고하였다.
첫째는 실험 방법상의 오류를 생각할 수 있다. mtDNA는 세포에서 핵 유전자에 비해 매우 적은 양으로 존재하며 또한 결손 변이 자체가 소수의 mtDNA에만 존재할 수 있기 때문에 실험상 오류가 발생할 수 있다. 그러나 분자생물학적 연구의 발전과 더불어 PCR에 의해 유전자 특정 부위를 증폭하여 극미량의 변이 부위도 측정이 가능해 짐으로써 이와 같은 문제점은 해결되었다. 과거 유전자의 추출과 확인 및 증폭에 적어도 1gm의 조직이 필요하였으나, Seidman 등은 마이크로그램 정도의 와우 조직에서도 본 변이를 확인한 바 있다. 본 연구에서 사용한 방법은 Ueda 등에 의해 백혈구에서 mtDNA 변이를 찾아낼 수 있음이 증명되었고, 본 연구 결과에서 primer 3, 4에 의해 PCR로 증폭된 부위가 전기영동 상에서 선명한 띠를 보이므로 변이가 없는 부분이 나타나며, sequencing을 통해 미토콘드리아 DNA가 정확히 추출되었음이 확인되었으므로, 실험 방법상 오류의 가능성은 매우 희박할 것으로 사료된다.
둘째는 혈액에서의 mtDNA 변이가 특정 조직의 mtDNA 변이를 정확히 반영할 수 있느냐 하는 문제이다. 본 연구와 같은 경우의 딜레마는 청각 조직을 사람의 생체에서 직접 생검하는 것이 불가능하며, 사체의 조직을 이용할 경우 고정과정의 약물에 의한 변이의 가능성을 완전히 배제하기 어렵다는 것이다. 또한 청각조직은 신경이나 근육조직처럼 일생동안 세포분열을 하지 않는(non-mitotic) 조직으로 이런 조직들은 마이토콘드리아와 마이토콘드리아 유전자의 turn over 주기가 수일 내지 수주로 비교적 빨라서 돌연 변이의 축적이 항진되게 되고 이것이 오랜 세월동안 지속적으로 진행되는 것으로 알려져 있지만, 생성과 사멸을 반복하는 혈구의 mtDNA를 이용한 연구의 결과가 신경이나 근육의 조직 특이성 mtDNA 변이를 얼마나 직접적으로 반영하는가 하는 의문을 낳게된다. 후천적 mtDNA 변이는 동일인에서도 조직에 따라 축적되는 정도의 차이가 매우 커서, 중추신경에서 caudate, 피각(putamen), substantia nigra가 소뇌보다 수백에서 약 2000 배까지 많은 변이를 보이는 것으로 알려져 있으며,¹⁸⁾ 와우에서도 mtDNA 변이의 위치와 축적된 양이 막성 미로와 spiral ganglion에서 각각 개인에 따라 다르다는 결과¹⁰⁾는 백혈구 mtDNA를 이용한 본 연구의 결과가 청각 조직 특이성의 변이를 직접적으로 반영할 수 없는 한계를 시사할 수 있을 것이다. 그러나 여러 연구들이 mtDNA가 풍부한 근육과 신경세포 등을 이용하여 조직 특이적 결과를 보고한 반면, Oshima 등, Ueda 등이 감각신경성 난청 환자에서, Shin 등은 MERRF 환자의 백혈구에서 mtDNA 변이를 보고하였고, Parker 등¹⁹⁾이 파킨슨 환자의 혈소판에서 mtDNA 변이를 증명한 점으로 보아 혈구내의 변이가 어느 정도 특정 조직의 변이를 반영할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 여기에서 주목해야 할 점은 Hattori 등이 일본인의 심근 세포의 부검을 통해 7.4 kb 결손 변이율이 30세 이하 0%, 31~40세 25%, 41~50세 33%, 51~60세 63%, 61~70세 75%, 70세 이상 100%로 노화가 진행됨에 따라 매우 큰 차이가 있음을 보고한 반면, Ueda 등이 백혈구를 이용한 검사에서 결손 변이의 발생률이, 비록 감각신경성 난청 환자에서 정상 청력인 보다 높으며 청력 소실의 정도와 비례하지만, 60세 이상의 노인군과 60미만 군에서 의미 있는 차이를 보이지 않았다는 점이다. 그러므로 일반적으로 노화가 진행됨에 따라 증가하는 것으로 알려져 있는 4977 bp 결손 변이를 백혈구가 완전히 반영하지 못 할 가능성을 추정할 수 있을 것이다. 또한 혈구를 이용한 연구들이 동일인에서 target organ의 변이와 혈구의 변이 발생률을 비교하지 않은 점은 아직도 이 문제점에 대해 해결해야 할 과제라고 할 수 있을 것이며, 이점은 비교적 mtDNA가 풍부하고 조직 생검이 용이한 근육세포와 백혈구의 변이를 비교 분석한다면 그 상관성을 알 수 있을 것으로 사료된다.
Bai 등은 노인성 난청 환자의 측두골에서 결손변이의 발생률이 높으나 결손 변이가 없는 환자가 있음을 인지하고 이것은 노인성 난청의 병리적 유형 차이로 생각하였다. Fischel-Gholdsian 등은 결손 변이와 동반된 point mutation의 존재 여부가 병리적 유형에 따른 차이를 설명할 것으로 생각하여 mtDNA cytochrome c gene의 point mutation을 와우의 stria vascularis와 spiral ganglion에서 각각 검사하여 정상 청력을 가졌던 사람보다 노인성 난청이 있었던 사람에서 변이의 발생이 높고 각각 조직에서 변이의 종류와 양이 다른 것을 확인함으로써 Bai의 가설을 증명한 바 있었다. mtDNA의 point mutation에 의한 질환은 40 여종이 이미 보고된 바 있으나, 1996년 Pallotti 등²⁰⁾은 정상 노화과정에서 평활근에 mtDNA point mutation이 축적되지 않는다고 보고하여 이 종류의 변이가 노화과정에서 축적이 되는 지는 아직도 논란이 있으나 노인성 난청의 발병에 미치는 영향에 대한 연구도 지속적으로 이루어 져야 할 것이다.
이상의 여러 점들을 종합해 볼 때 본 연구에서 백혈구에서 mtDNA 4977 bp 변이를 확인하지 못한 결과만으로 이 변이가 노화의 원인이며 노인성 난청의 원인이라는 가설을 부정하기보다는, 변이 발생에 한국인에서 유전학적으로 민족적 차이가 있을 가능성에 대한 연구의 기초 자료가 될 수 있을 것이다. 또한 백혈구와 특이 조직 사이에 변이 발생률의 상관관계의 증명이 필요함을 시사하는 자료가 될 것이다. 물론 노인성 난청의 병인 연구에서 와우 조직을 직접 검사하는 것이 가장 기본적이며 정확한 정보를 제공할 것이다. 그러나 이런 방법은 대상 선정과 방법적으로 매우 어려움이 있고 살아있는 사람에게서 시행이 불가능하다. 그러므로 본 결손 변이와 노인성 난청의 원인으로 추정될 수 있는 다양한 point mutation의 발생률이 직접 환자로부터 쉽게 채취할 수 있는 혈액과 특이 조직 사이에 어떤 상관관계가 있는지 규명된다면 임상에서 조기 진단과 예방 및 치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.

결     론

본 연구는 감각신경성 난청과 관련이 있을 것으로 보고되고 있는 mtDNA 4977 bp 결손 변이와 노인성 난청의 발병과의 연관성을 알아보고자 하였으나, 환자군과 대조군 전체에서 결손 변이를 발견할 수 없었다. 이상의 결과로 볼 때 4977 bp 결손 변이가 한국인에서 노인성 난청의 원인이라고 추정하기는 어려울 것이라고 사료된다. 그러나 추후 조직 특이성에 관한 의문점을 해결할 수 있는 연구가 이루어져야 할 것이며, 노인성 난청을 야기할 수 있는 다른 유형의 mtDNA 변이에 대한 다각적 연구가 병행되어야 할 것으로 사료된다.

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