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교신저자：여승근, 130-702 서울 동대문구 회기동 1번지
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서
론
돌발성 난청은 확실한 원인 없이 수시간 또는 3일 이내에 발생하는 감각신경성 난청을 말한다.1) 대부분의 경우 원인을 알 수 없으나 바이러스 감염, 혈관장애, 와우막 파열, 자가면역성 질환, 청신경종양 및 기타 원인 등이 알려져 있다.2) 그 중 혈관장애로 인한 혈관폐색, 혈전증, 출혈 그리고 혈관경련 등이 미로동맥에서 발생할 경우 순음청력도는 대부분 모든 주파수에서 청력이 감소하는 편평형을 나타낸다.3)4) 또한 미로동맥은 와우와 전정에 혈액을 공급하는 동맥으로서 혈관장애가 발생시 전정기능장애로 인한 어지러움 증상도 동반할 수 있다.5)
β2-glycoprotein I(β2GPI)은 apolipoprotein H로도 알려져있으며 혈장에서 농도가 200 μg/ml 정도가 되는 혈장 단백질이다.
β2GPI는 분자량이 50 kd되며 326개 아미노산으로 형성된 단인자표현의 당단백질이며 또한 complement contorl protein(CCP)의 한 종류이다. 이 당단백질의 생리학적 역할에 대해서 아직까지 확실히 알려져 있지 않지만
β2GPI는 음이온를 갖고 있는 인지질, 지질단백, 그리고 DNA 등과 같은 기질을 결합하며 인지질과 혈소판에 의한 응고작용에 대한 생체외실험에서 항응고작용을 하는 것으로 알려졌다.6)7) 또한
β2GPI는 전신성 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE)나 항인지질 증후군(primary antiphosphopholipid syndrom, APS) 환자 혈청에 존재하는 항인지질항체(antiphospholipid antibody)와 음이온 인지질(anionic phospholipid)을 결합시키는 필수적인 보조인자로 알려져 있다.8)9) SLE나 APS 같은 자가면역질환에서 환자 혈액에 있는 자아항체와 음이온 인지질과 반응하는데, 자아항체의 대부분은 음이온 인지질과 결합한
β2GPI 복합성 에피토프(complex epitope)에 반응하며,9) 이는 혈전혈색증(thromboembolic event)과 연관이 있다.10)11)
β2GPI의 제 5 도메인(the fifth domain)에 있는 두 개의 유전자 돌연변이가 엑손 7번에 코돈 306(TGC GGC)과 엑손 8번에 코돈 316(TGG TCT)에서 발견되었으며 이는
β2GPI와 음이온 인지질과 결합에 영향을 줄 것이라고 밝혀져 있다.12)13)14) SLE와 APS환자에서도 이미
β2GPI의 코돈 306과 코돈 316의 유전자 돌연변이가 확인되었으며 SLE 환자에서 엑손 8번 유전자 돌연변이가 독립적인 인자로서 혈전형성에 더 많이 관여한다고 알려져 있다.15)
돌발성 난청에서 자가 면역성 질환도 원인중에 하나로 알려져 있으며 SLE 혹은 APS 환자에서 돌발성 난청이 동반되어 발생한 경우도 있다.16)17) 돌발성 난청 환자에서 제2형 당뇨병이 동반된 경우가 16%정도가 되고 당뇨병이 동반된 환자군에서 더 심한 청력손실을 보이게 된다. 이는 당뇨병 합병증인 미세혈관손상이 혈액순환장애를 일으키고 나중에 혈전을 형성하여 발생하기 때문이다.18)19)20)
따라서 본 연구는
β2GPI의 코돈 306과 316의 유전자 돌연변이가 돌발성 난청의 발생과 연관이 있으리라 사료되어 그 발생 빈도를 알아보고, 유전자 돌연변이가 있는 군(mutant type)과 없는 군(wild type)사이에 임상양상에 차이점이 있는지 비교·분석 하였다.
대상 및 방법
대 상
2004년 3월부터 2005년 3월까지 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과에서 돌발성 난청으로 진단받은 환자 46명을 대상으로 하였다. 남자는 24명, 여자는 22명이었으며 나이는 15부터 75세로 평균 52세 이였다. 모든 환자에서 입원시 과거력, 가족력을 알아보고 순음청력검사, 지질검사(triglyceride, cholesterol), 공복혈당, 혈액응고검사(PLT, PT, APTT)를 시행하였다. 모든 환자는 발병 후 3일 이내에 입원 치료를 받았고 입원기간은 7일 정도였으며 스테로이드는 1 kg당 1 mg씩의 prednisolone을 4일간 경구투여 후 감량하였다. 청력회복 정도의 판정은 Siegel23)의 기준을 이용하였고(Table 1) Grade I-III을 청력회복으로 Grade IV를 청력회복이 안된 경우로 구분하였다. 청력회복정도는 퇴원 후 1개월 후에 순음청력검사를 기준으로 하였다. 정상 대조군으로 청력이 정상이고 자가면역질환이 없는 정상 성인 11명을 대상으로 하였다.
연구방법
게놈 DNA 분리(Genomic DNA isolation)
항응고제가 들어있는 EDTA 관에 환자로부터 3 ml의 혈액을 채취하였다. 게놈 DNA는 Wizard Genomic DNA 정제 방법(Promega, Medison, WL, USA)에 따라 혈액으로부터 분리하였다. 분리 방법은 300 μl의 혈액을 1.5 ml 시험관에 넣고 900 μl의 세포 용해액을 혼합하여 실온에서 10분간 둔 후 14,000 g로 1분간 원심 분리하여 상층액(supernatant)을 제거하였다. 침전물에 300 μl의 백혈구 용해액을 넣고 흔들어 준 다음 1.5 μl의 RNase 용액을 가하여 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 100 μl의 단백질 침전 용액을 첨가한 후 14,000 g에 3분간 원심 분리하였다. 새로운 1.5 ml의 시험관에 상층액을 옮긴 다음 300 μl의 isopropanol 용액을 첨가한 후 서서히 흔들어 주었다. 14,000 g에 1분간 원심 분리한 다음 상층액을 버리고, 침전물을 70% 에탄올로 3회 세척을 하였다. 14,000 g에 1분간 원심 분리하여 상층액을 완전히 제거하고 공기중에 15분간 침전물을 건조시켰다. 건조된 DNA를 100 μl의 용해액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6)에 용해 시킨 다음 spectrophotometer(Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Cambridge, England)를 이용하여 260 nm에서 DNA농도를 측정하였고,
A260/A280의 흡광도비로 DNA의 순도를 검정하였다.
중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)
β2GPI의 엑손 7과 8은 연쇄중합반응을 위해 제작된 시발체(primer)를 이용하여 유전자 증폭기(Biometra, Gottingen, Germany)에 의해 증폭하였다. 시발체는 Gushiken 등15)의 동일한 염기서열로 제작하였다. 엑손 7의 forward primer :
5'-CAAGTGGGAGTCCTAGCTAA-3', reverse primer : 5'-CCTGTGAAAAAGCCACTGTGGTGTACC-3', 엑손 8의 forward primer :
5'-TCCCCTTAGAATGTTTATCTTTTTCTCCCCC-3', reverse primer :
5'-AACAAGAAACAAGTGTGACATTTTATGTGG-3'로 합성하였다. 연쇄중합반응은 1 μg의 게놈 DNA, 1 x PCR 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM
MgCl2), 0.2 mM의 각 deoxynucleotide triphosphate(dNTP), 10 pmol의 각 시발체(exon 7과 exon 8), 1 U Taq DNA 중합효소(Takara, Shiga, Japan), 증류수를 포함하여 최종용량이 25 μl가 되게 하였다. 유전자의 증폭 조건은 초기 변성(denaturation)은 95℃에서 4분, 94℃에서 1분, 적정 부착 온도(annealing)은 55℃에서 1분, 연장(extension)은 72℃에서 2분을 30회 시행하였다.
증폭된 생성물의 제한효소 절단(Restriction enzyme digestion of PCR product)
증폭된 생성물을 PCR 정제 키트(DNA purification kit) 방법에 의해 정제하였다(Bioneer Daejeon Korea). 정제 방법은 1.5 ml 시험관에 생성물과 5배 용량의 결합 완충액(binding buffer)을 첨가하여 혼합한 다음 14,000 g에 1분간 원심분리 하였다. 500 μl의 세척용액을 넣고 14,000 g에 1분간 원심 분리를 하였으며, 동일한 방법으로 2회 반복 세척하였다. 세척이 끝난 후에 8 μl의 용해액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6)으로 용해시켰다.
Exon 7의 제한효소 반응은 정제된 생성물에 1 x 효소반응 완충액, 10% dimethyl sulfoxide(DMSO), 5 unit의 CviJ I(Chimerx, Milwaukee WI, USA), 증류수로 혼합하여 10 μl가 되게 조정 한 다음 37℃에서 16시간 반응을 시켰다.
Exon 8의 제한효소 반응은 정제된 생성물에 1 x 효소반응 완충액, 10 unit의
BstB I(New England Biolabs, Beverly, MA, USA), 증류수를 혼합하여 10 μl가 되게 한 후 65℃에서 16시간 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후에 2 μl의 6 x gel loading dye(30% sucrose, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol)을 혼합하여 0.5 μg/ml의 DNA 염색액(ethidium bromide)이 포함된 5% 한천 겔을 0.5 x 전기영동 완충액(45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA)으로 90 volt의 전압에서 1시간 이동시킨 다음 UV 영상 분석기(Gel Doc 2000 gel documentation system, Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 띠를 확인하였다.
DNA 염기서열 분석(DNA sequencing analysis)
연쇄중합반응에 의해 증폭된 생성물을 2% 한천 겔에 위와 동일한 방법에 의해 전기영동을 한 다음 겔로부터 DNA를 정제하였다(Bioneer Daejeon Korea). 정제 방법은 1.5 ml 시험관에 한천겔로부터 수거한 DNA에 5배 용량의 겔 결합 완충액을 첨가하여 60℃에서 10분간 둔 다음 동일한 용량의 isopropanol을 넣고 혼합한 후 14,000 g에 1분간 원심분리 하였다. 500 μl의 세척용액을 넣고 14,000 g에 1분간 원심 분리를 하였으며, 동일한 방법으로 2회 반복 세척하였다. 세척이 끝난 후에 10 μl의 용해액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6)으로 용해시켰다. 정제된 생성물을 자동 DNA 염기서열 분석기(ABI 301, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)에 의해 염기서열을 분석하였다.
통계 및 분석
돌발성 난청 환자에서 엑손 7번 혹은 엑손 8전의 유전자 돌연변이 유무 및 청력검사도, 임상검사결과와 상관성은 chi-square test와 Mann-Whitney U test를 이용하여 검증하였고, 유의 수준은 p<0.05로 정하였다.
결 과
PCR 증폭물을 CviJ 절편효소로 절단하였을 때 코돈 306에 유전자 돌연변이가 있는 경우에는 124, 86와 51 bp 세 개의 절편양상을 관찰할 수 있었으며 돌연변이가 없는 경우에는 124와 86 bp에서 두 개의 절편양상을 관찰 할 수 있었다. 모든 환자에서 124와 86 bp에서 두 개의 절편양상만 관찰할 수 있어 코돈 306에서 유전자 돌연변이는 없었다(Fig. 1).
코돈 316의 유전자 돌연변이는 PCR 증폭물을 BstB I 제한효소로 절단하여 확인하였다. 코돈 316 유전자 돌연변이가 있는 경우에는 86과 62 bp에서 두 개의 절편양상을 관찰할 수 있으며 유전자 돌연변이가 없는 경우에는 148 bp에서 절편되지 않은 하나의 절편을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 제한효소 절편을 시행하여 환자 4명에서 코돈 316의 유전자 돌연변이를 발견하였으며 DNA 염기서열 분석을 시행하여 다시 확인하였다(Fig. 3). 4명 모두 이형접합형 유전자 돌연변이였으며 동형접합형 유전자 돌연변이는 없었다.
돌발성 난청 환자 46명 중에서 엑손 8에 있는 코돈 316의 유전자 돌연변이는 4명에서 발견되었고 4명 모두 이형접합형이었으며 동형접합형은 없었다. 엑손 7에 있는 코돈 306의 유전자 돌연변이는 발견하지 못하였다. 정상 대조군에서는 유전자 돌연변이를 발견하지 못하였다(Table 2). 엑손 8 이형접합형 유전자 돌연변이가 있는 4명 중에서 순음청력검사에서 2명이 농이었고 2명이 중등도난청을 보였으며, 청력회복은 모두 15 dB 미만 이었다. 순음청력검사도에서 3명은 편평형이고 1명은 U형이었다(Table 3). 이명이나 어지럼증을 동반된 경우는 없었고 안면신경마비(Bell's palsy)를 동반된 환자 1명, 당뇨병을 동반한 환자 1명, 고혈압을 동반 한 환자 1명이 있었다(Table 4).
혈중 콜레스테롤과 트리글리세리드는 wild type 군에서 정상범위에 있었지만 mutant type 군에서는 정상치보다 높았다. 혈당은 양군 모두 정상치보다 높았고 mutant type 군에서 더 높은 양상을 보이지만 통계적인 유의성은 없었다. 프로트롬빈시간과 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간은 mutant type 군에서 더 짧은 양상을 보이지만 통계적으로 유의하지는 않았다(Table 5).
고 찰
돌발성 난청 발병원인 중에 혈관장애로 인한 것이 많이 알려져 있고 유전자 돌연변이가 있는 군에서 혈전증이 더 많이 발생하는 것은 돌발성 난청을 일으킬 수 있는 중요한 요인이 되기도 한다. 혈관폐쇄, 혈전증, 출혈, 및 혈관연축과 같은 혈관장애로 인하여 발생 한 돌발성 난청환자에서 순음청력도는 편편형을 보이게 되는데 이런 경우 모든 주파수에서 청력이 감소하는 난청을 보이게 된다. 이는 와우의 혈액공급은 미로동맥 하나로 이루어지기 때문에 미로동맥에 혈관장애가 발생한 경우에 돌발성 난청이 발생된다고 알려져 있다.3)4) SLE나 APS와 같은 자가면역질환에서 엑손 7(코돈306)과 엑손 8(코돈316)의 유전자 돌연변이가 확인되었으며 그 빈도는 5.6%와 7.7%로 정상인과 비슷한 빈도를 보이고 있다. 하지만 엑손 8 유전자 돌연변이가 있는 군에서 혈전증이 더 많이 생성되는 경향이 있다고 알려져 있다.15) 본 연구의 경우 환자 46명 중 엑손 8번에서 유전자 돌연변이는 8.7%의 빈도를 보였고 엑손 7번에서는 유전자 돌연변이를 발견하지 못하였다. 엑손 8번의 유전자 돌연변이는 모두 이형접합형이었으며 동형접합형은 없었다. 순음청력도는 엑손 8번 유전자 돌연변이가 있는 환자 4명 중 3명이 편평형 이었고 다른 한명은 U-shaped type 순음청력도를 보이고 있으며 이런 순음청력도는 청력회복이 낮은 것과 연관이 있을 것으로 생각되었다. 따라서 본 연구에서도 돌연변이가 있는 환자의 경우 스테로이드 치료 후 청력회복은 모두 15 dB 미만이었으며 이중 두 명은 전농 상태로 회복되지 않았다.
β2GPI의 생리적 기능에 대해서 아직까지 확실히 밝혀지지는 않았지만 이는 자연 항응고작용(natural anticoagulant)과 관련이 있으리가 보고 있다.
β2GPI는 in vivo에서 음이온 인지질 교질입자(anionic phospholipid micelles)나 혈소판 미세소포(platelet microvesicles)를 결합시키며 혈액순환에 있는 이런 소포를 정제하여 혈전형성을 막아주는 역할을 하게 된다.21)22)
β2GPI의 제 5 도메인은 인지질을 결합시키는 매개체 역할을 하게 된다. 이미 발견된
β2GPI의 제 5 도메인에 있는 코돈 306과 코돈 316의 유전자 돌연변이는 음이온을 띤 Phosphatidylserine과 결합하지를 못한다. 코돈 306(TGC→GGC)에 있는 과오돌연변이(missense mutation)로 인하여 Cys306이 Gly306으로 바뀌게 되고 Cys281과 Cys306사이의 디설피드결합을 분열시켜 정상적인 배열이 바뀌게 된다. 코돈 316(TGG→TCG)에 있는 과오돌연변이의 경우는 Trp316이 Ser316으로 바뀌게 되고 313-316 위치에 있는 4개의 보존된 소수성 아미노산((hydrophobic amino acid)을 분쇄시킨다. 코돈 306과 코돈 316에 존재하는 각각의 동형접합형 유전자 돌연변이 혹은 이형접합형 유전자 돌연변이가 같이 존재하는 경우에는 음이온 인지질 결합을 현저하게 감소시키고 이형접합형 유전자 돌연변이가 발생하게 된다. 유전자 돌연변이를 갖고 있어 인지질 결합이 감소되면 이로 인하여 음이온 인지질 혹은 세포표면에 존재하는 procoagulant anionic phospholipid를 정제하는데 실패하여 이런 음이온 인지질이 혈전을 형성할 것으로 생각된다.12)13)
본 연구에서 코돈 306의 유전자 돌연변이는 없었지만 코돈 316에서 4명의 이형접합형 유전자 돌연변이를 발견하였다. 하지만 음이온 인지질 결합을 감소시키는 동형접합형이나 코돈 306과 316에서 같이 존재하는 이형접합형 유전자 돌연변이는 발견하지 못하였다. 본 연구만으로는 음이온 인지질 결합의 감소로 인한 혈전형성이 돌발성 난청의 원인임을 입증할 수는 없었지만 코돈 316에서 존재하는 이형접합형 유전자 돌연변이는 돌발성 난청 환자에서 청력회복에 나쁜 영향을 미침을 알 수 있었다.15)
결 론
돌발성 난청 환자에서
β2GPI의 엑손 7(코돈 306) 유전자 돌연변이는 발견하지 못하였고 환자 4명에서 엑손 8(코돈 316) 유전자 돌연변이를 발견하였으며 모두 이형접합형이였다. 엑손 8(코돈316) 유전자 돌연변이가 있는 환자군은 모두 청력회복이 15 dB이하로 청력회복이 불량하였다.
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