Histotechnology of Cat Temporal Bone：Celloidin-Embedded Method

Hong, Nam Pyo; Byun, Jae Yong; Lee, Dong Yeop; Ahn, Hwoe Young; Cha, Chang Il

Original Article

Auditory and vestibular disorders

Korean Journal of Audiology 1997;1(2):123-130.

Histotechnology of Cat Temporal Bone：Celloidin-Embedded Method

Nam Pyo Hong, Jae Yong Byun, Dong Yeop Lee, Hwoe Young Ahn, Chang Il Cha

Department of Otolaryngology, College of Medicine, KyungHee University, Korea

Celloidin 포매를 이용한 고양이 측두골의 병리조직학적표본 제작에 관한 연구

홍남표^, 변재용^, 이동엽^, 안회영^, 차창일

경희대학교 의과대학 이비인후과학교실

Abstract

In biomedical research, especially in otologic and vestibular research, the biologic models are frequently necessary. So it is very important for investigator to select the ideal experimental model of a particular investigation. The cat is probably the most commonly used animal in vestibular research, because cats are widely available and relatively cheap to purchase and maintain. And several excellent stereotaxic atlas of the brain, temporal bone and inner ear are avaliable. Cats are relatively free from infection after either brain or inner ear surgery and are good chronic animal. To achieve successful investigation results with cat temporal bone, it is very important to know the cat temporal bone anatomy including middle and inner ear structures and more to get histotechnology of celloidin-embedding method of temporal bone. Cat temporal bone has relatively large volume and calcium components. Therefore we used celloidin-embedding methods because celloidin-embedded methods is more proper method than usual paraffin-embedded method in histotechnologic study of cat temporal bone. And all serial sections of cat temporal bone were done in horizontal plane. We were able to have excellent serial sections of cat temporal bone and to get many detailed information about anatomical structures in middle and inner ear of cat temporal bone. We investigated the cat temporal bone to get the detailed anatomical knowledge by celloidin-embedded method. And we hope it could be a contributional study for the animal experiment of middle and inner ear research with cat.

Keywords: Celloidin;Cat;Temporal bone;Histotechnology.

서론 이과질환의 원인 및 병리조직학적 경과를 규명하는데 있어서 측두골 및 그 주위조직의 해부학적 구조를 이해하고 주요 구조물의 병변의 변화를 아는 것이 매우 중요하다. 그러나 이를 인체의 측두골을 이용할 경우 연구가 매우 어렵고 관찰할 수 있는 시기가 부적절하므로 인체 대신 각종 동물에게 이와 유사한 병변을 유발시키고 사후 그 측두골을 추출해서 병리조직학적 연구를 함으로써 병인론과 병의 진행과정들에 관한 많은 정보 및 지식을 가질 수 있어서 이를 임상에 이용하고 있다. 이런 동물실험을 이용한 측두골의 병리조직학적 연구를 위해 쥐, 기니픽, mongolian gerbil, chinchilla, 고양이, 원숭이 등이 실험동물로써 다양하게 이용1)되고 있으며 실험동물의 선택은 실험의 목적에 따른 적합성, 실험동물의 수명, 실험에 사용되는 경비와 연구 기관의 시설 및 여건에 따라 좌우된다. 그러나 한국에서는 아직 여러가지 요인 및 여건에 의해 주로 쥐, 기니픽, mongolian gerbil 등만이 중이 및 내이의 연구에 사용되고 있는 실정이고 아직 고양이나 원숭이 등의 측두골을 이용한 실험 및 연구는 활발히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 그러므로 가까운 미래에 우리 나라에서도 선진국에서와 마찬가지로 인체의 측두골에 대한 연구가 이루어질 때를 대비하기 위해 특히 측두골의 용적이 커서 칼슘 성분이 많은 원숭이 및 인체의 측두골의 조직표본을 만들 때 사용하는 celloidin포매법을 이용하여 고양이 측두골의 병리조직학적 표본을 만드는 실험을 하였다. 재료 및 방법 미국 Wake Forest University의 Bowman Gray School of Medicine내의 이비인후과학교실 부설 측두골 연구실에서 중이염이나 이과적 질환을 앓거나 앓고 있지 않는 고양이를 이용하였다. 약 3kg 내외의 성숙된 실험용 고양이는 실험 8시간 전부터 금식시킨 후 ketamin 0.19mg/kg, xylazine 0.05 mg/kg을 복강 내로 마취시킨 후 수술대 위에서 흉곽을 개방하여 하행대동맥을 결찰한 후 생리식염수 1,000cc와 10% formalin 1,000cc를 혼합한 용액을 심장 관류시킨 후 두개골을 척추로부터 분리한 다음 양측 측두골을 노출된 두개골의 기저부로부터 각각 조심스럽게 적출 하였다. 적출된 양측 측두골은 10일간의 고정 기간, 약 2∼3주간의 탈석회화과정, 5일간의 중화(Neutralization) 및 세척과정, 11일간의 탈수과정, 10주간의 celloidin포매액에 의한 포매과정, 4∼8주간의 경화과정(Hardening) 등을 거친 후 sliding microtome을 이용한 wet method하에서 측두골을 수평면과 평행한 horizontal section으로 20 microne의 두께로 조직표본을 제작하여 Hematoxylin-Eosin 염색을 하고 mounting해서 광학현미경하에서 관찰하였다. 결과 각 10번째 조직표본의 절편은 따로 모아 완성된 측두골의 병리조직표본(평균 고양이의 측두골에서는 35∼40장의 조직표본이 만들어진다)은 광학현미경하에서 중이 및 내이의 구조를 관찰할 수 있었다(Figs. 1-5). 중이 및 내이의 구조물들은 인체의 측두골의 해부학적 구조와 거의 유사하였으며 특히 달팽이관은 인체와 거의 동일한 회전을 보였고 내이 및 중이의 훌륭한 실험적 동물로서의 구조를 관찰할 수 있었다. 고찰 이과질환의 원인 및 병리조직학적 경과를 연구하는데 있어 측두골의 병리조직학적 연구는 가장 근본이 되는 연구방법으로서 인체에서는 이 재료를 쉽사리 구하기 어렵고 관찰할 수 있는 시기가 부적절하므로 대신 쥐, 기니픽, mongolian gerbil, chinchilla, 고양이, 원숭이 등의 측두골을 대상으로 주로 사용하고 있다. 그러나 쥐, 기니픽, mongolian gerbil 등은 측두골의 크기 및 구조가 인체와 많이 다르고 수명이 짧아 장기간의 실험대상으로는 부적합하며, chinchilla는 아직 우리 나라에서는 고가로 구입하기가 힘들며 흔히 중이염을 가지고 있어서 중이염 외의 다른 실험목적으로는 실험대상으로 부적합하고, 원숭이는 인체와 가장 유사한 구조의 측두골을 가지고 있으나 매우 비싸고 실험동물의 유지관리가 매우 어려워 선진국에서도 일부의 측두골 연구실에서만 한정되게 사용되고 있다. 이에 반해 고양이의 측두골은 인체와 아주 유사한 측두골의 구조와 특성을 가지고 있으며 생명력이 강해 실험적 수술이나 조작 후에도 쉽게 감염이 되지도 않고 동물의 수명이 비교적 길어 어떤 실험조건이나 중장기간의 연구기간에 매우 적합하며 가격도 그다지 비싸지 않아 측두골의 병변을 연구하기 위한 실험동물로서 매우 적합하여 중이 및 특히 평형기관의 병리 생태를 중장기간 관찰하고 연구하는데 매우 적합한 동물로서 선택되고 있다.1) 또한 측두골 외에도 대뇌, 소뇌 등을 포함한 중추신경계의 신경해부학적 구조 및 전달구조에 관한 정보가 거의 다 완성되어 문헌으로 보고되어 있어 청각기 및 전정기능의 연구에 매우 유익한 실험동물로서 사용되고 있다.1) 고양이의 측두골은 측두골의 용적이 비교적 크고 다량의 칼슘성분을 함유하고 있어 원숭이나 인체의 측두골 연구에서 사용되는 celloidin포매법이 연구에 적합하므로 고양이 측두골의 병리조직학적 표본제작의 기초 및 근간을 이룩하고자 이에 대한 제작법에 관한 연구를 하였다. 실험대상 동물의 희생전 처치 및 측두골의 추출 실험대상의 고양이는 실험 8시간 전부터 금식을 시켜 실험 도중의 질식을 미리 예방하여야 한다. 실험적 조작이 완성된 고양이를 희생하기 위해서는 ketamine 0.19 mg/kg, xylazine 0.05mg/kg 을 복강내 주입으로 마취시킨 후 수술실험대 위에 놓고 흉곽을 개방하여 하행대동맥을 결찰하고 생리식염수 1,000cc와 10% formalin 1,000cc을 혼합한 용액을 18 gauge정도의 바늘을 통해 좌측 심실 내로 주입하여 약 600∼700cc정도를 서서히 심장 관류시키면서 좌측 혹은 우측의 심방을 일부 개방하여 심장관류액의 유입으로 인한 혈액 및 관류 액의 배출을 확인하였다. 이때 심장관류를 통한 고정이 충분히 이루어졌는지를 알아보기 위해서는 고양이의 악관절이나 상지의 관절을 움직였을 때 충분히 경직되었는지를 확인하면 된다. 심장관류 후 두개골을 척추로부터 분리시키고 분리된 두개골은 대후두공을 통해 후방으로부터 후두골 및 두정골을 먼저 제거하고 협골을 노출시킨 후 노출된 대뇌 및 소뇌를 적출하게 되는데 이때 내이도를 통해 측두골내로 들어가는 안면신경 및 제 8 뇌신경 수술 칼로 조심스럽게 내이도 입구 부에서 절제하여 측두골 내에 잘 보존되도록 하여야 한다. 양측 측두골을 노출된 두개골의 기저부로부터 조심스럽게 적출 하였다. 적출된 양측 측두골은 우선 붙어 있는 근육 등을 제거하고 측두골의 bulla의 가장 기저부에 약 4∼5mm 직경의 구멍을 충분히 뚫어 고정 액의 침투가 용이하게 하였다. 고정과정(fixations) 적출된 양측 측두골은 각각 측두골의 용적의 약 20배 되는 용량의 20% Formalin 용액이 담겨있는 용기 내에 넣어 처음 24시간을 냉장고 내에 보관한 다음 2일간은 같은 용량의 10% neutral buffered formalin(이하 N. B. F.로 약함) 용액을 매일 교환하면서 냉장고에서 보관하고, 4일째에는 다시 한번 새로운 10% N. B. F.용액으로 갈고 냉장고 내에서 7일 동안 보관한 다음 10일째 되는 날 다시 한번 용액을 교체하고 계속 보관하든지 탈석회화과정으로 옮아간다. 다른 실험실의 경우에서는 고정액으로 Heidenhain susa용액2)과 formalin을 4：1로 혼합한 용액을 사용하기도 한다.3) 만약 전자현미경으로의 관찰을 요하는 경우에glutaraldehyde를 이용하기도 한다.2) 이 기간 동안 매일 1∼2회씩 고정액속에 담긴 측두골을 회전시켜 주어서 측두골 내에 함유된 기포가 bulla의 기저부에 뚫어놓은 구멍으로 완전히 빠져나오게 한다. 탈석회화과정(decalcification) 뼈조직은 매우 단단하여 조직표본제작과정에서 탈석회화과정을 반드시 거쳐야하는데 탈석회화방법으로는 acid method, ion-exchange resin을 이용하는 방법, electrical ionization 방법 및 EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid) 등의 chelating 용액을 이용한 chelating method 등이 사용되고 있는데, 주로 acid method를 많이 사용하고 있으며3)4) 저자도 이 방법을 사용하였다. Acid method의 경우에는 약 20%에서 compression artifact가 생긴다는 보고도 있다.2) Acid method에 사용하는 용액으로는 주로 10% formalin에 1% nitric acid가 함유된 용액이나 5% trichloroacetic acid2)를 사용하는데 저자는 전자의 용액을 사용하였다. 고정과정이 끝난 측두골을 고정시와 같은 용량의 이 용액 속에 넣어서 매일 용액을 갈아주어야 한다. 이 탈석회화과정 중에서 중요한 점은 탈석회화과정에 발생하는 기체가 용기 내에서 빠져나올 수 있게 용기의 뚜껑에 작은 구멍을 내어서 사용하여야 한다. 약 1주일 후부터는 탈석회화과정의 적정점(end-point)을 결정하기 위해 saturated ammonium oxalate와 5% saturated ammonium hydroxide를 사용하는 화학적 검사방법으로 탈석회화과정이 충분히 되었는지를 검사하였다. 이 검사방법은 눈금이 있는 25cc정도의 cylinder에 5cc의 saturated ammonium oxalate와 5cc의 5% saturated ammonium hydroxide를 넣고 측두골이 담겨져있는 용기의 기저부로부터 5cc의 10% formalin에 1% nitric acid 탈석회화용액을 옮겨 넣어 4시간정도 방치한 후 검은 배경아래에서 그 투명도를 육안으로 측정한다. 이 탈석회화과정의 완결유무에 관한 검사는 3일 연속으로 투명도가 나타날 때까지 시행한다. 저자의 경우에서는 대개 완전 탈석회화까지 2∼3주정도 소요되었다. 인체 측두골의 경우에서는 연속 5번의 검사에서 투명도가 나타날 때까지 시행한다.2) 탈석회화과정의 적정점(end-point)을 결정하는 방법에는 저자와 같이 화학적 방법으로 결정하는 것외에 연화가 충분히 되었는지 바늘로 찔러 보아서 검사하는 방법, 만져서 쉽게 구부러지는지를 시험해 보는법 및 X선을 주기적으로 조사해서 정하는 방법4)이 있으나 대부분에서는 표본의 손상을 막기 위해 저자와 같은 방법이 시행되고 있다. 중성화 과정 및 세척과정(neutralization & washing) 탈석회화가 완전히 확인된 측두골은 탈석회화용액을 제거하기 위해 중성화 과정을 거치게 되는데, 우선 용기내의 탈석회화용액(10% formalin에 1% nitric acid가 함유된 용액)을 버리고 대신 5% sodium sulfate용액을 넣고 실온에서 24시간 방치하는 과정을 2일 동안 연속해서 시행하고, 3일째에 흐르는 수돗물(running tap water)이 용기의 바닥에 오도록 관을 설치해서 흘러 나가는 과정을 24시간 동안 시행하고, 5) 마지막 2일간은 증류수를 용기 내에 넣어서 매일 갈아주면서 실온에서 방치하는데 총 5일간의 중성화 및 세척과정을 요하게 된다. 탈수과정(dehydration) 측두골의 완전한 탈수는 11일간 저 농도의 알코올 용액에서부터 고농도로 매일매일 옮기면서 시행하는데 35 % ETOH(ethyl alcohol), 50% ETOH, 70% ET-OH, 80% ETOH, 95% ETOH, 95% ETOH, 100% ETOH, 100% ETOH, 100% ETOH, 25/75 Anhydrous Ethyl Ether/100% ETOH, 및 50/50 Anhydrous Ethyl Ether/100% ETOH의 순으로 옮기면서 시행한다. 특히 4일째 80% ETOH로 옮기기 전에는 이미 탈석회화되어 부드러워진 측두골을 꺼내어 날카로운 칼로서 전방으로는 추체부의 첨부를, 후방으로는 bulla의 후방을, 하방으로는 이미 만들어 놓은 bulla의 구멍을 좀 더 크게, 상방으로는 추체부의 상연을 따라 평행하게 잘라내어서 첨단부에 조그만 구멍을 낼 정도로 각각 구멍을 뚫어 용액들이 측두골의 중이와 내이속으로 잘 침투할 수 있는 경로를 만들어 주어야한다. Celloidin을 이용한 포매과정(embedding with celloidin) 일반적으로 측두골 동물실험에서 사용되는 포매액으로는 paraffin, celloidin, glycol methacrylate(GMA) 및 methyl methacrylate 등이 있는데, paraffin이나 glycol methacrylate는 작은 동물의 측두골 연구에서 주로 사용되고 있고 celloidin은 칼슘성분을 많이 함유하고 있는 원숭이나 인체의 측두골 연구에서 주로 사용되고 있다. 고양이의 측두골도 용적이 비교적 커서 paraffin 이나 glycol methacrylate 등을 이용한 측두골 연구에서는 좋은 병리조직표본을 얻기가 어려워서 주로 celloidin포매를 이용한다. Celloidin은 cellulose를 sulfuric acid 및 nitric acid로 처리해서 얻은 nitrocellulose의 정화된 물질로서, 기존의 paraffin 및 glycol methacrylate 등과 같은 연성의 포매액보다도 자궁, 안구 및 뼈 등의 단단한 장기의 병리조직학적 연구에 적합하며 제작과정에 열을 가하는 과정이 없어 조직의 축소나 경화되는 일이 없이 조직 구조물이 잘 보존되고 태아 등의 큰 조직이나 장기의 연구에 유익한 장점을 가지고 있다.3-5) 단점으로는 포매과정이 길고, block을 항상 70∼80% alcohol속에서 보관하여야 하므로 경비가 많이 들며, 10 microne 이하의 두께로는 절편을 만들기가 힘든 점이다.4)5) 이런 Celloidin포매액으로 포매하기 위해서는 우선 탈수과정의 마지막 용액인 50/50 anhydrous ethyl ether/100% ETOH으로부터 꺼낸 측두골을 미리 준비된 celloidin 포매액(Table 1)4)중 우선 4% celloidin 포매액이 담긴 용기로 옮기고 용액 속에서 측두골을 상하좌우로 회전시켜서 측두골 내에 함유되어 있는 공기가 빠져나가도록 하고 용기의 뚜껑을 완전히 폐쇄해서 1주일동안 담아놓는다. 이와 동일한 과정으로 8% celloidin, 12% celloidin, 15% celloidin 포매액속에서 각각 3주씩 담아놓아 측두골내에 포매액이 완전히 침투할 수 있도록 해야한다. 다른 연구실의 경우에서는 1.5%, 3%, 6% 및 12% celloidin의 순2)으로 47℃의 배양기 아래에서 시행하기도 한다.7) 경화과정(hardening) 총 10주간의 포매과정이 끝나면 15% celloidin 용액 속에 든 측두골을 측두골의 절단을 시작하고자 하는 면(주로 추체부의 상연부터 시작한다)이 용기의 바닥에 오도록 위치시키고 용기의 뚜껑을 완전히 한번 잠군 후 다시 약간 느슨하게 풀어준 다음, 측두골 및 15% celloidin 용액이 든 용기보다 큰 용기를 이 위에 뒤집어 씌운 상태로 1주일을 둔 다음 3∼4일 간격으로 측두골이 든 용기를 뒤집어 보아 15% celloidin용액이 움직이지 않을 정도까지 경화되면 손가락으로 측두골을 포함하고 있는 굳은 block을 손가락으로 용기의 내면으로부터 떼어내고 다시 용기의 뚜껑을 완전히 잠군다음 약간 느슨하게 풀어주는 방식으로 해서 며칠간 방치한다. 측두골을 함유한 포매액의 block이 완전히 굳어지면 용기에서 꺼내어 6면체 모양으로 block을 칼로 잘라서 만들고 완전히 경화시키기 위해서 다듬어진 이 block 을 원래의 용기에 넣고 후드 아래에서 1∼2 cc의 chloroform을 용기에 넣고 뚜껑을 완전히 밀폐시킨 상태로 24 시간을 놓아둔다. 다음날 다시 1∼2 cc의 chloroform으로 교체하여 1∼2일간 보관하여 완전히 굳도록 한다.4) 이 block이 완전히 굳으면 용기 내에 들어있던 chloroform을 버리고 50/50 chloroform/cedar wood oil의 혼합용액을 block이 충분히 이 용액들 속에서 떠있을 정도로 충분히 부어넣고 뚜껑을 밀폐시키고 48시간 정도 방치하면 완전히 경화가 되면서 반드시 block이 가라앉게 되는데2) 이 가라앉은 block을 꺼내어서 100 % cedar wood oil의 용액이 담긴 용기 속에 넣어 암소에서 보관한다. cedar wood oil은 절편을 제작하기에 용이하게 되도록 해주는 역할을 한다.2) 병리조직표본제작 과정(sectioning) 준비된 xylene 속에 든 fiber-block(6면체로써 한면은 요철의 표면을 가지고 있다)2)을 꺼내 50/50 ether/alcohol용액이 든 용기내로 옮겨 요철면이 바닥에 오도록 위치시켜 충분히 탈수가 되도록 한다. 100% cedar wood oil속에 든 측두골 표본block을 끄집어내어 추후 fiber-block에 단단히 붙을 수 있도록 fiber-block의 요철면과 접착하게 될 측두골 표본 block의 한면에 격자모양의 흠집을 내고 50/50 ether/alcohol용액에 잠시 담구어둔 다음 fiber-block의 요철면에 15% celloidin용액을 설압자로 충분히 바르고 이 위에 측두골 표본 block의 이미 흠집을 낸 면이 마주보도록 올린 다음 손바닥으로 강하게 눌러 이 두개의 block 사이를 강하게 접착시키고 이 사이에서 빠져나오는 15% celloidin용액이 사방 측면에 고르게 퍼지게 도포 하면서 입김으로 서서히 말린다. 충분히 접착이 되면 chloroform 5cc가 든 용기 내에 fiber-block이 아래에 오도록 해서 하룻밤을 보낸 후, 다음날 아침 이 block을 꺼내어 용기 속에 이번에는 fiber-block이 위로 오고 표본 block이 아래로 가도록 위치시킨 다음 cedar wood oil을 부어서 보관한다. 조직표본을 절단하기 전에 준비된 표본 block의 한 모서리를 미리 정하고(예를 들면 측두골의 좌측 후면 등으로 정해서) 표시해서 나중에 표본의 염색 후 표본의 절편만으로 측두골의 좌우 및 전후를 판단할 수 있는 지표로 삼게 한다. 250mm 길이의 절단칼을 가진 sliding mirotome(American Optics Co. 미국)의 절단칼의 연이 표본 block의 외측 연과 약 30°정도의 사각을 이루도록 고정시키고3) 80% ETOH을 조직표본의 절단면 위에 계속 점적시키면서 시행하는 wet method6)로 20 microne의 두께로 절단해 나간다. 이때 측두골 골편의 block을 수평면으로부터 후방으로 약 15°정도 기울여 고정하고 연속절편을 만들어 나가면 midmodiolar section이 만들어져서 달팽이관의 3회전을 모두 관찰할 수 있게 만들 수 있다.2) 연속 절편을 만들기 시작하면 절단된 절편이 절단칼의 상면에 놓이게 되는데 매 첫번째부터 아홉번째까지의 절편들은 미리 연필로 일련번호가 쓰여진 onion skin paper에 camel’s hair brush를 이용하여6) 한장씩 붙어있게하여 일련번호 순서대로 95% ETOH가 든 용기내에 따로 모으고 매번 10번째의 절단된 절편은 95% ETOH가 든 다른 용기 내에 각각 10개씩 모아서 보관하여 병리조직표본 제작시 사용한다.6) 이때 유의할 점은 약 200번의 연속절단 후에는 다시 절단칼의 연이 잘 들게 갈아서 사용해야 된다. 조직표본의 제작이 다 끝나면 모아진 조직표본절편이 붙은 onion sk-in paper는 굵은 무명실로 묶어서 80% ETOH가 든 용기 속에 따로 보관하여 나중에 필요한 경우에 조직표본을 다시 만들 수 있게 한다. 절편된 10번째마다 모은 절편들은 10개의 절편씩 조를 짜서 Hematoxylin-Eosin 염색(Table 2)을 하고 coverslipping 하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 결론 이과질환의 병인론 및 질병의 경과를 규명하는데 있어서 여러 동물의 측두골이 실험대상으로 사용되고 있으나 실험의 목적이나 용도상 고양이를 이용한 측두골 연구의 필요성이 점차 증가함에 따라 고양이 측두골의 해부학적 구조와 병리조직학적 구조를 이해하는 것이 추후 고양이를 이용한 측두골의 병리조직학적 표본제작실험에서 기초가 되리라고 사료되고 이를 잘 발달시켜 가까운 미래에 한국에서 가능해질 인체 측두골의 표본제작과정에 기초자료로써 활용될 것으로 사료된다.
REFERENCES
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