| Experimental Study on IL-6 Gene Expression in Cholesteatoma |
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Chul Won Park, Young Ho Jang, Dong Suk Muhn |
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Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea |
| 진주종조직에서 IL-6 유전자의 발현에 대한 연구 |
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박철원, 장영호, 문동숙 |
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한양대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| Abstract |
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Cholesteatoma is composed of hyperproliferative keratinizing epithelium in the middle ear cavity. Its pathogenesis of destruction is not clear, however theories such as pressure effect of cholesteatoma, enzymatic destruction from monocyte, cytokines including interleukin, tumor necrosis factor, and etc, are believed to be possible pathogenesis. Recently, overexpression of EGF, TNF, and IL-1α in cholesteatoma tissue have been suggested to correlate with bony destruction, but IL-6 has seldomly been reported to correlate with osteoclast excitatory function. To examine the potential role of IL-6 in the pathogenesis of cholesteatoma and its bone destruction, we investigated gene expression in cholesteatoma tissue as well as in the normal postaural skin using RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) technique, and obtained the following results. 1) In 10 cases of cholesteatoma, IL-6 band was expressed at 628 bp size marker site in 2 cases, while in normal postaural skin it was not expressed in all cases. 2) All of 2 cases which were expressed IL-6 had severe bone destruction. 3) In 4 cases of over 5 year disease history, IL-6 expression were noted in 2 cases. In conclusion, the higher expression of IL-6 in cholesteatoma with severe bone destruction suggest that IL-6 plays a major role in proliferation and growth of cholesteatoma as well as excitatory effect for bone destruction by cholesteatoma. But quantative test will be needed to clarify this point.
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| Keywords:
IL-6;Cholesteatoma;RT-PCR. |
서론
진주종은 중이강내의 각질화 상피세포의 과다증식으로 생기며 계속 과다증식하면 이로 인해 골파괴를 일으킬 수 있다. 그러나 진주종의 기원, 증식, 골파괴의 기전에 대해 명확히 알려지지 않았으며 최근 이에 대한 관심이 증가되어 왔다. 이중에서도 진주종성 중이염에 의한 골파괴로 심각한 합병증을 초래하는 기전에 대해 활발한 연구가 진행되고 있으나 아직 확실한 것은 없는 실정이다. 지금까지 연구되어 온 골파괴 기전은 골자체에 압력으로 인한 괴사, 각종 분해 효소에 의한 골흡수, 만성 골수염, 수소이온농도의 변화, 그리고 여러 cytokines의 활성에 의한 골흡수 등이 복합적으로 작용하고 있다. 이중 다양한 cytokines의 상호작용에 의한 파골세포의 활성화로 인한 골흡수가 주요한 작용을 하리라 생각되고 있다. 진주종 조직에서는 Interleukin-1α(IL-1α), tumor necrosis factor, 그리고 colony-stimulating factor 등의 cytokines이 상승되어 있어 이들이 염증작용을 일으킨다고 알려져 있다. Interleukin-6(IL-6)는 진주종내의 각질화 상피세포, 림프구, 섬유아세포 및 대식세포 등의 다양한 세포들로부터 생성되며 진주종에서의 역할은 아직까지 보고가 미미한 상태이다. 이에 저자들은 수술시에 얻은 진주종 조직과 정상 후이개 피부조직에서 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 통해 IL-6의 발현을 관찰하고 이를 진주종의 골파괴 정도와 비교하여 진주종 조직에서의 IL-6 발현정도 및 이의 골파괴에 대한 기능을 알아보는 기초자료를 얻고자 본 연구를 시행하였다.
연구대상 및 방법
조직채취
한양대학병원 이비인후과에서 만성 진주종성 중이염으로 진단받고 수술받은 환자 13례를 대상으로 수술시에 진주종 조직을 얻어 Eppendorf tube에 넣은 즉시 액화질소용기에 보관하여 운반 후 영하 70° 냉장고에 보관하였다.
Total RNA의 추출
Total RNA를 추출하기위해 약 100 mg의 조직을 멸균된 Eppendorf tube에 옮긴 후 RNA의 손실을 막기위해 RNAse inhibitor인 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 구성된 solution D(guanidin thiocyanate, DEPC-dH2O, sodium citrate, sarcosyl)를 첨가하고 motor homogenizer로 균질화시켰다.
RNA를 침전시키기 위해 균질화된 조직에 2 M sodium acetate(pH 4)를 넣고 protein을 제거하기 위해 phenol과 chloroform을 혼합시켰다. 여기서 얻은 재료를 10,000 gram, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층부위를 새 tube에 옮기고 핵산침전이 잘 되도록 isopropanol을 첨가하여 영하 20°에서 1시간 이상 침전시킨 후에 다시 isopropanol을 첨가하고 원심분리하였다. 75% ethanol을 첨가하고 원심분리하여 깨끗이 정제후에 얻어진 RNA pellet을 1시간동안 건주 후 50 ul의 DEPC dH2O에 부유시켰다. 추출된 RNA pellet을 증류수로 100배 희석하여 sphectrophotometer로 260 nm에서 OD(optimal density)값을 구하였다.
Reverse Transcription(역전사)
Messenger RNA(mRNA)에서 complementary DNA(cDNA)를 합성하는 reverse transcription을 위해 추출된 RNA 2 ug에 8 ul dH2O를 혼합 후 70℃에 10분간 보온하였다. dNTP(nucleotide), RNASIN(RNAse inhibitor), MMVL-RT(reverse transcriptase), DTT, random Hexamer, 5x RT buffer를 혼합 후 37℃에서 90분간 보온 후 95℃에서 10분간 반응시켜 mRNA를 cDNA로 reverse transcription시켰다.
PCR(polymerase chain reaction：중합효소 연쇄반응)
cDNA를 PCR로 증폭시키는 과정으로 reverse transcription과정에서 얻은 cDNA 5 ul에 각각 50 pmole의 primer, 1.25U Taq polymerase, 10x PCR buffer, 200 uM dNTP, 1.5 mM MgCl 2, dH2O를 혼합하여 반응시켰는데 primer로는 IL-6 각각 sense primer와 antisense primer를 사용하였고(Table 1), 반응조건은 변성반응을 위해 95℃에서 1분, 결합반응을 위해 65℃에서 30초, 연장반응을 위해 72℃에서 1분으로 하였고 모두 35 cycle을 시행하였다.
Electrophoresis(전기영동)
PCR로 증폭된 cDNA를 전기영동시키는 과정은 2% agarose gel에 5 ul/ml Ethidium bromide염색한 후 10 ul의 PCR 반응물과 2 ul gel-loading buffer를 넣고 0.5x TBE buffer에서 100 Voltage로 시행하여 각각의 band를 관찰하였다.
실험반응의 정확성을 확인하기위해 β-actin primer를 이용하여 RT-PCR을 시행 후 band를 관찰하였고 양성대조군으로 chondrocyte를 사용하였고 음성대조군으로는 cDNA대신 dH2O를 사용하였다.
Chart Review
진주종의 골파괴 정도를 비교 조사키위해 환자 chart를 조사하여 유병기간, 수술소견상 골파괴 정도를 검토하여 IL-6의 발현 정도와 비교 분석하였다.
결과
13개의 진주종 조직중 OD값이 1.5이상인 10개의 조직에서 RT-PCR을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) 10개의 진주종 조직중 2례에서 628 bp size marker 부위에 IL-6 band가 관찰되었으나 정상 후이개 피부조직에서는 band가 보이지 않았다(Table 2).
2) 실험의 정확성을 위해 실시한 β-actin의 발현은 진주종 조직 및 정상 후이개 조직 모두에서 661 bp size marker 부위에 band가 잘 관찰되었고, 양성 대조군으로 실시한 chondrocyte에서의 IL-6 발현은 양성으로 나타났으며 음성대조군에서는 band가 관찰되지 않았다(Fig. 1).
3) 진주종의 유병기간에 따른 IL-6의 발현은 2례 모두에서 유병기간은 5년 이상이었다(Table 3).
4) 수술 소견상 골파괴 정도가 광범위하였던 4례중 2례에서 IL-6가 발현되었다(Table 4).
고찰
중이강내의 각질화 상피세포의 축적으로 생기는 진주종이 계속 과다증식하면 이로 인해 인접된 골을 파괴하게 된다. 이러한 골파괴에 대한 병인론은 진주종 팽창에 의한 골흡수, 단핵구 조직세포에서 분비하는 여러 효소에 의한 골흡수, 수소이온농도의 변화, 그리고 IL, TNF, EGF 등 여러 생물학적 요소로 인한 파골세포의 활성에 의한 것 등 여러 가설이 알려져 있으나1-4) 아직 밝혀지지 않은 부분이 많다.
지금까지 연구된 바에 의하면 Moriyama 등5)은 상피세포와 간질세포간의 반응으로 진주종이 골파괴를 일으킨다고 하였고, Bernstein6)은 중이염에 대한 일차 방어로 면역반응이 관여할 것이라 하였으며 Yellon 등4)은 중이삼출액에서 cytokines이 염증반응과 면역반응에 중요한 매개체라 하였다. 그러나 최근에는 여러 cytokines의 상호작용에 의한 파골세포의 활성화가 골흡수를 일으키는데 주요한 작용을 하리라 생각되고 있다.
다양한 성장 인자와 cytokines이 진주종의 병인론에 관여한다고 알려져 왔으며 IL-1, TNF, 그리고 CSF는 진주종 조직에서 높게 관찰되었고7)8) EGF, TGF-α, 그리고 IL-1은 각질화 상피세포의 증식능을 증가시킨다고 보고되었다.9-11) 따라서 이런 cytokines의 변화가 진주종의 골흡수를 야기하는데 중요한 역할을 한다.12)
IL-6는 상피세포, 림프구, 섬유아세포 및 대식세포 등의 다양한 세포들에서 형성되며 림프구, 섬유아세포, 간세포 및 대식세포 등 표적세포의 성질에 따라 성장유도, 성장억제 및 분화유도 등의 다양한 효과를 나타낸다.12) 그러나 진주종에서의 역할을 아직까지 보고가 미미한 상태이다. IL-6의 비정상적인 발현은 자가면역질환, 골수종, 증식성 사구체신염의 병인에 관련되며13)14) 천포창과 같은 표피세포의 증식성 질환에서 관찰되는데15) 이는 진주종의 증식성상과 비슷하기 때문이다.11)12) 진주종 조직내의 IL-6는 주로 대식세포와 섬유아세포 등의 간질세포에서 형성되며 또한 진주종조직에서 정상피부조직보다 IL-6가 높게 나타나는 것은 이런 간질세포 뿐만 아니라 각질화 상피세포에서 발현이 높게 나타나기 때문이고12) 또한 IL-6의 발현은 IL-1, TNF, platelet-derived growth factor 등의 cytokines에 반응하여 발현이 증가된다.16)17) 본 연구에서는 진주종 조직중 골파괴가 심한 4례중 2례에서 IL-6가 발현되었다. 반면 IL-4는 파골전구세포가 파골세포(osteoclast)로 분화되는 것을 방지하여 골흡수를 방어한다고 알려져 있다.18) 또한 골세포에 있어서의 TGF-β는 조골세포 증식과 분화 및 골단백질의 형성을 상승조절하나, 파골세포의 수와 활성도는 저하조절하여 진주종 증식과 성장에 방어 작용을 함으로써 골흡수를 억제한다고 보고되고 있다.19)20)
이상과 같이 진주종은 골흡수를 촉진하는 TNF-α, TNF-β, IL-1 및 EGF 등의 cytokines과 아직 보고가 미미한 IL-6가 있으며 아울러 IL-4, TGF-β 등의 골흡수를 억제하는 cytokines으로 요약할 수 있다. 따라서 본 연구에서 10개의 진주종 조직중 2개에서 IL-6가 발현되어 비교적 낮은 발현율을 나타낸 것은 이런 IL-4, TGF-β 등의 골흡수를 억제하는 자연적인 억제물질 때문이라고 사료된다.
RNA를 분석하는 가장 일반적인 방법은 northern blotting으로 mRNA의 크기와 상대적인 양을 측정할 수 있다. 그러나 민감도가 낮아 위음성이 많은 단점이 있다. RT-PCR은 조직에서 total RNA를 추출해서 reverse transcription 시키면 mRNA에서 complementary DNA(cDNA)를 얻을수 있고 이를 바탕으로 PCR을 시행한 후 전기영동을 통해 band를 관찰하면 mRNA의 gene발현정도를 알 수 있다. PCR은 분석하려하는 DNA영역을 수 십만배로 증폭할 수 있으므로 극미량의 검체로도 분석이 가능하다.
본 연구에서도 진주종 조직 및 정상 후이개 피부조직을 사용하여 IL-6, chondrocyte, 그리고 β-actin에 대해 RT-PCR을 시행하였는데 β-actin은 인체내의 어떤 세포에서든지 존재하여 mRNA를 발현하는 gene으로서 다른 gene의 mRNA 발현을 규명하는 실험에 있어 그 정확성을 확인하는 기준으로 많이 이용되고 있다.
향후 진주종에서의 IL-6의 작용을 확실히 알기위해서는 IL-6가 생성되는 세포를 in situ hybridization, immunohistochemistry, keratinocyte assay 등과 같은 방법으로 규명해야 할 것으로 사료되며 IL-6가 작용하는 수용체에 대한 연구도 필요하겠다. 또한 IL-6 이외의 골흡수에 관여하는 cytokines와 골흡수를 억제하는 cytokines에 대한 정량적인 검사를 병행하여야 진주종의 골파괴에 관한 기전을 정확히 알 수 있겠다. 그러나 본 연구에서 5년 이상의 유병기간과 골파괴가 심한 경우에 IL-6가 발현된 점을 볼 때 IL-6는 진주종의 골파괴 병인에 직접 혹은 간접적으로 연관이 있다는 것을 알 수 있었다.
결론
진주종의 골파괴에 대한 기전 및 면역반응을 보다 정확히 알려면 한가지의 cytokine으로는 설명할 수 없고 여러 cytokines에 의한 종합적인 상관관계로 설명할 수 있겠다. 저자는 아직 진주종에서의 그 기능이 잘 알려지지 않은 IL-6의 발현을 측정하여 다른 cytokines과의 연관성을 알아본 결과, 유병기간이 오래되고 골파괴가 심한 경우에 IL-6가 발현된 것으로 볼 때 IL-6가 골흡수를 강하게 하는 cytokines중의 하나임을 알 수 있었다. 그러나 이 점을 확실히 하기 위해서는 앞으로 IL-1, 4, 6, TGF-β 및 그 외의 파골세포와 연관된 여러 cytokines들의 정량적인 분석과 각각의 진주종 상태를 비교하여 진주종의 골파괴 기전이 명확해 진다면 진주종의 병리를 잘 알게되어 이 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있을 것이다.
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