A Morphological Study on the Cochlea in the Rats of Na-Salicylate Induced Ototoxicity

Lee, Hye Yong; Yeo, Sang Won; Chae, Sae Yong; Choi, Young Chul; Park, Yong Soo; Kim, Jin

Original Article

Anatomy and physiology

Korean Journal of Audiology 1998;2(2):124-129.

A Morphological Study on the Cochlea in the Rats of Na-Salicylate Induced Ototoxicity

Hye Yong Lee¹, Sang Won Yeo¹, Sae Yong Chae¹, Young Chul Choi¹, Yong Soo Park¹, Jin Kim²

¹Department of Otorhinolaryngology-Head Neck Surgery
²Anatomy, College of Medicine, The Catholic University, Seoul, Korea

Na-Salicylate의 이독성이 흰쥐의 와우에 미치는 영향

이혜용^¹^, 여상원^¹^, 채세용^¹^, 최영철^¹^, 박용수^¹^, 김 진^²

^¹가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
^²해부학교실

Abstract

Salicylates are the most commonly used drugs, but produce a unwanted side effects such as mucosal bleeding in the gastrointestinal tracts. Ototoxicity is another side effect of high-dose of salicylate treatment with reversible hearing loss and tinnitus. The purpose of this study was to investigate the hearing thresholds as time goes by and morphologic changes of cochlea on salicylate ototoxicity. Twenty eight rats were used and all of the animals had their baseline hearing threshold measured by auditory brain stem response (ABR) audiometry. Except control group, animals were injected with 500 mg/kg of sodium salicylate. And then animals were followed up with ABR for 2 to 72 hours. Hair cells and structures were observed with light microscope. Salicylates have a unique effect on hearing and the hearing loss seldom exceeds 40 dB, and auditory threshold returns to normal after the drug being withdrawn. Light microscopic examination did not reveal any morphological changes in the organ of Corti and stria vascularis. These results suggest that the mechanism of Na-salicylate induced ototoxicity is related to a reversible biochemical or metabolic changes in the cochlea.

Keywords: Na-salicylate;Ototoxicity;Rat;ABR;Morphology.

서론 비스테로이드성 소염제중 Na-salicylate는 해열, 소염, 진통 및 항응고제로 널리 사용되는 약제로서 과량 사용시 청력 감소를 일으킬 수 있어 이러한 약제를 사용해야 하는 환자에서 발생할 수 있는 이독성 효과에 대하여 많은 관심을 가지게 되었다. 그러나 aminoglycoside계 항생제나 cisplatin이 심한 영구적인 청력 손실을 나타내는 것에 반해 Na-salicylate는 가역적 청력 손실을 일으킨다고 보고되었다.1) Na-salicylate에 의한 청력 손실은 대부분 40 dB를 넘지 않으며 약물의 사용을 중지하면 72시간 내에 정상 청력으로 회복되는 일과성 청력 손실(temporary threshold shift, TTS)의 형태를 보인다고 한다.2)3) 청력 손실은 salicylate의 혈중 농도가 40 mg/dl까지는 비례하여 전 음역에서 40 dB까지 청력 역치가 상승하지만 개체간의 차이가 있으며 혈중 농도가 더 증가하여도 더 이상 청력 소실은 일어나지 않는다고 알려져 있다.6) Na-salicylate의 청력 소실 유발 기전 및 이독성이 미치는 부위는 명확히 알려져 있지 않으나 작용기전으로 제시된 주장들은 와우효소계의 일시적인 변화,5) prostaglandins합성 억제제로서의 작용,6)7) 내이 신경전달물질의 변화3) 등 여러 가지가 있으나 salicylate 이독증의 원인을 한가지로 규정하기에는 어려운 실정이다. 또한 임상 연구 및 동물실험에서 salicylate의 작용 부위가 와우인 것은 가정할 수 있으나 조직병리학적 변화는 발견할 수 없었다.2)8) 본 연구의 목적은 흰쥐에 Na-salicylate를 투여한 후 뇌간유발반응검사를 시행하여 청력 역치의 시간에 따른 변화와 와우의 형태학적 변화를 광학현미경으로 관찰하여 Na-salicylate의 이독성이 내이에 미치는 영향을 알아보고자 이 연구를 시행하였다. 재료 및 방법 실험 동물 음향성 자극이나 이독성 약물에 노출된 바 없으며 고막소견이 정상이고 외이 및 중이에 염증이 없는, 청성뇌간유발반응검사를 시행하여 정상 청력소견을 나타내는 체중 300±50 g의 생후 12주 정도 된 건강한 Wistar 흰쥐 28마리(56 귀)를 암수 구별없이 사용하였다. 방법 흰쥐 28마리를 케타민(ketamine, 유한양행) 30 mg/kg와 xylazine hydrochloride 2 mg/kg(유한양행)를 근육주사하여 마취를 한 후 모든 동물에서 청성뇌간유발반응검사를 시행하였다. 4마리(8귀)는 대조군으로 Na-salicylate 주입 전에 청성뇌간유발반응검사를 시행하고 도살하여 측두골 채취 후 와우를 관찰하였다. 24마리(48귀)는 Na-salicylate(영진약품) 500 mg/kg(300 mg/kg를 복강내 주사하고 2시간 후에 200 mg/kg를 추가로 피하주사)를 주사하였다. 피하 주사 후 각각 2, 4, 6, 24, 48, 72시간 후에 양측귀에서 청성뇌간유발반응검사를 시행하였으며 마지막 청성뇌간유발반응검사 후 도살하여 측두골 채취 후 와우를 관찰하였다. 조직표본 제작 실험동물은 마지막 청성뇌간유발반응검사 후 복강 내에 urethane(1.15 g/kg, Sigma, St Louis, Mo)과 케타민(5 mg/kg)을 주사하여 마취한 후 heparinized saline 100 ml(saline 100 ml에 25,000 unit heparin 0.3 ml 혼합, 녹십자)와 0.1 M PBS 완충용액을 이용하여 pH 7.4로 맞춘 4% paraformaldehyde(Sigma, St Louis, Mo)로 심장 관류 고정을 시행한 후 즉시 두부를 절취하고 양측 측두골을 적출한 후 수술현미경 하에서 중이골포를 제거하여 난원창, 정원창 및 와우첨단을 개방한 후 4% paraformaldehyde 용액으로 1일간 추가 고정하였다. 그 후 절취된 측두골을 8% EDTA(Sigma, St Louis, Mo)와 4% paraformaldehyde 혼합용액으로 6주간 탈회시킨 후 4% paraformaldehyde로 24시간 고정하였다. 파라핀에 포매한 후 4 μm의 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켜 헤마톡실린과 에오진으로 염색을 한 후 광학현미경 하에서 관찰하였다. 청력 역치 측정 뇌간유발반응검사는 방음실 안에서 Navigator SE ABR audiometer(evoked potential report version 5.0, Bio-logic, USA)를 이용하였고 음자극은 10 inch의 음전도관을 갖는 insert headphone을 통하여 rarefaction phase의 broad band click 음(100∼3000 Hz)을 반복자극률 12.5 Hz로 가산평균하여 90 dB부터 시작하여 10 dB간격으로 10 dB까지 주었다. 청성뇌간유발반응검사는 주사침 전극을 이용하여 활성전극을 동측 이개하부에, 비교전극은 두정부에, 접지전극을 상대측 이개하부에 부착하였으며 전기저항은 5 kΩ 이하로 하여 그 반응을 증폭, 여과하여 기록하였다. 청력의 역치는 판별 가능한 뇌간유발반응검사파형을 나타내는 최저 자극음의 크기로 하였고 자극음의 크기에 따른 파형의 소실 및 잠복기의 변화를 관찰하기 위하여 latency-intensity curve를 작성하였다. 결과 청력 역치 소견 흰쥐에서 Na-salicylate 주입 전의 청력역치는 28마리(56귀) 모두 15.5±5.1 dB 이내의 청력을 보였다. Na-salicylate 주입 후 2시간, 4시간, 6시간의 청력 역치는 각각 40±5.3 dB, 46.3±4.6 dB, 40±3.3 dB로 약제 주입 전과 비교해 모두 역치 상승을 보였다. Na-salicylate 주입 후 24시간의 경우 21.3±3.5 dB로써 부분적으로 회복되는 양상을 나타내었다. Na-salicylate 주입 후 48시간 및 72시간에서는 청력 역치가 각각 17.5±7.1 dB, 11.3±3.5 dB로 모두 회복되었다. 이상의 Na-salicylate 주입 후 시간 경과에 따른 청력 역치 상승의 변동을 관찰해 보면 약제 주입 2시간 후에 시작된 청력 손실은 4시간 후에 정점에 도달한 후 24시간 후에 부분적으로 회복되며 72시간 이후에는 완전히 회복되었다(Figs. 1 and 2). 광학 현미경 소견 약제 투여군의 코르티기관(organ of Corti), 혈관조(stria vascularis) 및 나선 신경절(spiral ganglion) 모두 특이한 형태학적 변화는 없어 정상 대조군과 약제 투여군 사이의 차이는 관찰할 수 없었다(Fig. 3A, B, C and D). 고찰 약물에 의한 이독성은 내이 즉 와우와 전정부에 대한 약물 작용에 의하여 청력이나 평형 감각에 장애가 오는 것으로 현재 임상적으로 쓰이는 약물중 이독성물질은 aminoglycoside 계열의 항생제와 이뇨제, 비스테로이드성 소염제와 항암제가 있다. Salicylate는 소염, 진통, 해열제로 널리 쓰이는 비스테로이드성 약제로서, 류마토이드 관절염이나 기타 결체조직 질환에 사용되는 치료 용량으로도 이명 및 청력 손실을 가져올 수 있다.4)9)10) Salicylate의 생체내에서의 약리기전은 arachidonic acid cascade에 의한 prostaglandin의 합성에 관여하여 cycloxygenase를 억제하고4)6)11-13) 혈중의 칼슘농도를 감소시키고, 세포막의 이온 수송을 저지한다고 알려져 있으나14) 이독성의 기전은 정확히 밝혀진 바 없으며, 청력기관에 대한 이독성의 작용부위 역시 와우로 추정하고 있으나9)10)15)16) 아직까지 논쟁의 초점이 되고 있다. McFadden 등 2), Myers 등 4)은 Na-salicylate에 의한 청력 소실은 대부분 40 dB를 넘지 않으며 약물의 사용을 중지하면 정상 청력으로 회복되는 일과성 청력 소실의 형태를 보인다고 하였다. 한편 청력 소실과 투여량과의 관계는 salicylate의 혈중 농도가 40 mg/dl까지는 비례하여 전 음역에서 40 dB까지 청력 역치가 상승하지만 혈중 농도가 더 증가하더라도 더 이상의 청력 소실은 일어나지 않는다고 하였으나,4)8) Bernstein 등10)은 사용용량에 비례하여 25∼45 dB까지 청력 소실을 보고하였다. 저자들은 본 연구에서 2회 간격으로 salicylate를 투여하여 37∼67 mg/dl의 혈중 농도를 얻은 Deer 등16)과 Myers 등4) 의 보고에 근거하여 2시간 간격으로 salicylate를 투여한 결과 약 47 dB까지 청력 소실이 있었으며 salicylate 혈중농도를 따로 측정하지는 않았으나 Deer 등16)과 Myers 등4)의 보고에 따르면 40 mg/dl 이상일 것으로 사료되며 이들의 결과와 일치되는 40 dB 이상의 청력 소실을 보였다. 한편 salicylate로 인한 청력 손실은 복강내 투여된 salicylate가 외림프에 최고 농도를 나타내는 2시간 후에 청력 손실이 가장 컸고 36∼48시간까지 서서히 회복되다 72시간 후에 정상으로 돌아온다고 하였 다.1)4)5)7)12)15)17)18) Salicylate 이독성에 대한 형태학적 연구에서 Mc-Cabe 등 9)은 salicylate 이독성의 위치는 와우내부로서 와우관내 구조물의 기계적인 전위 때문인 것으로 추론하였으며, Shehata 등 19)은 salicylate의 독성농도에서 외유모세포를 실험실에서 분리 배양하여 조직 병리학적으로 관찰한 결과 외유모세포 표면 하 cisternae의 수포화 및 가역적인 부종이 보임을 보고하였다. 반면에 Myers 등,4) Deer 등,16) Cazals 등,17) Falk20)은 형태변화를 관찰할 수 없었다고 하였다. 류마토이드 관절염으로 아스피린 복용 후 청력 손실이 있었던 사람의 측두골 표본역시 경미한 혈관조 위축 이외의 다른 와우 미세구조의 변화를 발견할 수 없었다.8) 또한 전기생리학적 검사에서 와우 역치(cochlear potential(sensory response)의 변화없이 활성 전위(action potential(neural response))만이 감소하였으나 청신경의 병변은 발견할 수 없었다.4)11)15)17) 이상으로 어떤 일관성 있는 현미경적 변화는 묘사되어지지 않았다. 본 실험에서도 Na-salicylate의 가역적인 이독성에 의해 코르티 기관 및 혈관조에서 대조군에 비해 청력 손실을 뒷받침할만한 형태학적 변화를 수반하지 않음을 보여 Cazals 등, Myers 등의 결과와 일치함을 보였다. 4)15)16)17)20) 그러므로 salicylate의 일과성 이독성은 이것이 해부학적 또는 혈관조 위축과 같은 형태학적 변화8)가 아닌 생화학적 또는 대사과정의 이상에 의한 것임을 시사한다고 할 수 있다. 이독성의 기전에 대해 Cazals 등17)은 아스피린을 투여한 기니픽에서 조직학적 변화는 발견할 수 없었지만 교감신경에 의해 지배되는 와우 측벽의 혈관 수축을 보고하고, 따라서 salicylate의 이독성을 혈관 운동장애,,혈관 울혈, 혈류 정체 등으로 설명하였다. Escoubet 등7)과 Jung 등, 6)12)13)18)은 salicylate가 아라키돈산 대사과정의 cyclooxygenase를 억제하여 와우 측벽, 즉 나선판과 혈관조에서 생산되는 prostaglandin의 생성 억제로 혈류 장애가 와서 이독성이 온다고 하였고, 이때 외림프액에서의 prostaglandin 농도는 청력 손실의 정도에 반비례하였고 leukotriene 농도는 비례한다고 하였다. Dexamethasone과 leukotriene inhibitor를 전처치하여 salicylate 이독성을 부분적으로 예방할 수 있었다는 보고는13)18) salicylate 이독성이 아라키돈산 대사변화에 의한 것임을 시사한다고 할 수 있다. 그러나 salicylate에 의한 아라키돈산의 대사 변화가 어떻게 이독성을 나타내는지는 잘 알려져 있지 않다. 아라키돈산의 많은 대사산물들이 혈관 운동성을 가지므로 salicylate에 의한 cyclooxygenase의 억제가 혈관확장제인 prostaglandin을 감소시키고 혈관수축제인 leukotriene을 증가시키므로써 와우 혈류량을 감소시켜 세포막 투과 수송의 변화, 외유모 세포의 전도(conductance)를 변화시킴으로써 이독성을 나타낸다고 추정하고 있다.12) 반면 Puel 등3)은 강한 cyclooxygenase 억제제인 mefenamate와 meclofenamate 투여 후에 와우 역치에 변화가 없었음을 보이며 salicylate 이독성이 prostaglandin 합성억제에 의한 것이 아니라 다른 기전에 의한다고 하였다. 또 다른 기전으로는 salicylate가 와우내에서 산화 인산화 과정(oxidative phosphorylation)에 관여하여 라이너스막의 ATP를 저하시키는 대사장애로 청력 손실이 온다고 하였다.1)5) 한편 최근에는 salicylate 투여 후 자연 이음향 방사(spontaneous otoacoustic emission)가 감소하였다고 보고해 외유모세포가 salicylate 이독성의 병변 부위임을 나타낸다고 하였는데 그 이유는 salicylate 처치 후 외유모세포가 수축하고(loss of turgidity) 운동성(electromotility)이 감소하여 세포막 전도가 변화한다고 하였다.2)14)19) 결론적으로 본 실험에서는 실험동물에 Na-salicylate를 주입하였을 때 청력 역치의 가역적인 변화를 보였으며 Na-salicylate의 가역적인 이독성에 의해 흰쥐의 내이에서 형태학적 변화를 수반하지는 않는 것으로 보아 생화학적 혹은 대사과정에 영향을 줌을 시사한다. 그러므로 Na-salicylate 이독성의 기전을 규명할 수 있는 연구가 앞으로 더 필요하다고 생각된다. 결론 Na-salicylate가 청력 역치와 와우의 형태학적 구조에 미치는 영향을 알아보기 위하여 28마리의 흰쥐에 Na-salicylate 500 mg/kg(300 mg/kg를 복강내 주사하고 2시간 후에 200 mg/kg를 추가로 피하주사)를 주사하였다. 피하 주사 후 각각 2, 4, 6, 24, 48, 72시간 후에 양측귀에서 청성뇌간유발반응검사를 시행하였으며 마지막 청성뇌간유발반응검사 후 도살하여 측두골 채취 후 와우를 광학 현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 약물 주입 후 2시간, 4시간, 6시간의 청력 역치는 각각 40±5.3 dB, 46.3±4.6 dB, 40±3.3 dB로 약제 주입 전에 비교해 모두 역치 상승을 보였다. 2) 약제 주입 4시간 후에 청력 손실은 46.3±4.6 dB로 정점에 도달하였다. 3) 청력 손실은 약물 주입 24시간 후부터 부분적으로 회복되는 양상(21.3±3.5 dB)을 보이다가 72시간 후에는 모두 회복(11.3±3.5 dB)되었다. 4) 정상 대조군과 약제 투여군 사이에 코르티 기관, 나선 신경절 및 혈관조 모두 형태학적 변화는 없었다. 이상의 결과에서 Na-salicylate에 의한 청력 손실은 가역적인 변화로서 약물의 사용을 중단하면 정상 청력으로 회복되며 내이에 형태학적 변화는 일으키지 않는 것으로 보아 생화학적 또는 대사과정에 영향을 주어 일과성 청력 손실을 일으킨다고 추정되나 Na-salicylate에 의한 청력 손실 기전에 대해서는 앞으로의 연구가 더 필요하다고 생각된다.
REFERENCES
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