| Comparison of Noise Induced Expression of 72 kD Heat Shock Protein and Heat Shock Transcription Factor-1(HSF-1) in Rat Cochlea |
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Hyung Ro Chu, Sung Dong Cho, Seung Kuk Paik, Jung Jun Kim, Chan Gi Yoo, Hak Hyun Jung, Hyun Ho Lim |
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Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea |
| 소음자극 후 흰쥐의 와우에서 72 kD Heat Shock Protein과 Heat Shock Transcription Factor-1(HSF-1)의 발현의 비교 |
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주형로, 조성동, 백승국, 김정준, 유찬기, 정학현, 임현호 |
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고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| Abstract |
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The activation of heat shock gene transcription during the stress response is mediated by heat shock transcription factor (HSF), which bind to heat shock elements (HSE) in promoters of heat shock genes. The purpose of this study was to determine the presence of HSF-1 in cochlea hair cells and to investigate its role in cochlea by observing the change in its expression after noise exposure. Spague-Dawley rat was exposed to broad band noise with 110dB SPL and cochleae were harvested at 2, 4 and 6 hours after stimulation. Surface preparation method was used to detect the expression of HSP 72 and HSF-1 in the cochlear tissues. HSP 72 immunoreactive staining was seen in cytoplasm at 4 hours after stimulation and the stronger immunostaining was obtained at 6 hours after stimulation. HSF-1immunoactive staining showed a diffuse pattern in the cytoplasm and the nucleus of outer hair cells in normal cochlea. The level of HSF-1 immunoreactivity in its intracellular expression site was changed 4 hours and 6 hours after noise exposure. The result sugg-est that HSF-1, which exist in normal hair cells, plays a role in the production of HSP 72 by binding to a DNA binding site after stress.
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| Keywords:
HSF;Cochlea;Noise. |
서론
사람을 비롯한 포유동물들의 청각기관은 소음, 저산소증, 독성약제 등의 자극에 매우 예민하여 자극의 강도에 따라 일시적 또는 영구적인 청력소실을 일으키게 한다.1)2)
최근 세포생물학 분야의 발전으로 외부의 자극에 대한 세포의 방어작용에 대하여 각 분야에서 활발한 연구가 진행되었으며,3) 모든 세포는 환경, 화학적 및 생리적 자극에 반응하여 빠르고 선택적으로 heat shock protein(HSP)이라는 특이 단백질을 합성하여 세포보호작용을 하는 것으로 알려져 있다.4-6)
HSP은 분자량에 따라 여러 종류의 HSP족(family)로 구분되며, 이중 HSP 70족은 자극이 가하여지지 않은 정상세포에서 관찰되는 구성형(constitutive form)인 HSP 73과 자극 후에 생성되는 유발형(inducible form)인 HSP 72와 더불어 분자량 78 kD인 당조절단백(glucose regulated protein) 등으로 이루어져 있다.7)
자극에 반응하여 단백질을 합성하는 열자극 유전자(heat shock gene)는 heat shock transcription factor(HSF)로 불리는 DNA 결합단백질에 의하여 조절되며, HSF는 활성화되면 trimer 형태로 DNA와 결합하여 HSP을 합성하는 것으로 알려져 있다.8)9) HSF는 4가지 종류가 밝혀져 있으며, 이중 HSF-1은 자극을 받은 세포에서 활성화되고 HSF-2는 세포 분화과정에서 나타난다.
본 연구의 목적은 소음자극 후 흰쥐의 와우에서 면역조직화학염색법을 이용하여 자극에 반응하여 활성화 되어 발현되는 HSP 72와 HSF-1의 발현양상과 분포를 확인하고 그 역할에 대하여 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
HSP 70족 중 유발형 HSP인 HSP 72와 HSF-1의 유발을 관찰하기 위하여 소음에 노출되지 않은 정상 대조군과 소음자극을 준 실험군에서 일정시간 경과에 따른 발현양상의 변화를 면역조직화학 염색법을 이용하여 관찰하였다.
실험동물 및 음 자극
실험동물로는 정상 이개 반응(Preyer reflex)을 보이는 체중 200∼250 mg의 수컷 흰쥐(Spague-Dawley rat)를 각 실험군에 세마리씩 12마리를 사용하였다. 소음자극은 음자극을 위하여 고안된 상자에 실험동물을 넣고 110 dB SPL의 광역대 잡음에 90분간 노출시켰다. 음자극 후 일정시간이 경과하여 희생시킬 때까지 조용한 곳(sound-proof booth)에서 보관하였다. 대조군으로는 음자극을 주지않고 희생시까지 조용한 장소에서 보관한 동물을 사용하였다. 음자극 후 2시간, 4시간, 6시간 경과 후 실험동물을 희생시켰다.
검체의 처리
실험동물에 Nembutal(pentobarbital sodium, 60 mg/kg)을 복강 내에 주사하여 마취한 후 개흉하여 심장을 노출시켰다. 좌심실의 끝부분을 절제하여 18 gage 주사바늘을 상행동맥에 삽입하고 결찰 한 후 우심방을 절제하여 heparin(2.1 U/cc)를 첨가한 0.9% 생리식염수로 관류하여 혈액을 씻어내었다. 연속적으로 고정액(4% paraformaldehyde in 0.1 mol/L sodium phosphate buffer, pH 7.4)으로 관류하여 고정하였다. 고정된 쥐의 두개골에서 측두골을 분리하여 동일한 고정액으로 난원창과 정원창을 통하여 고실 내 관류고정을 한 후 동일 고정액에서 16시간(overnight) 동안 고정하였다. 와우의 표면전처치(surface preparation)를 위하여 해부현미경 하에서 와우를 미세해부 하였으며 일측은 HSP 72의 염색에, 다른 측은 HSF-1의 염색에 사용하였다.
면역조직화학적염색
면역조직화학적염색법을 위하여 사용한 일차항체는 항HSP 72 단클론항체(StressGen사, 1：500)와 항HSF-1 단클론항체(NeoMarkers사, 1：500)이며, 항원-항체 결합을 검출하기 위하여는 Vectastain ABC kit(Vector Laboratory사)를 이용한 avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)법으로 시행하였다. 표면전처치한 검체를 상온에서 0.3% H2O2/PBS에 10분간 처리한 후 5분씩 3회 인산완충식염수로 세척하였다. 조직내의 비특이반응을 줄이기 위하여 3% normal goat serum에 1시간동안 실온에서 처리한 후 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척하였다. 일차항체(HSP 72, 1：500；HSF-1, 1：500)는 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 조직은 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후 이차항체(bitinylated streptoavidin kit, Labvision Laboratory) 용액에 실온에서 한시간 동안 반응시킨 다음, 세척 후 DAB(0.05% 3.3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride/0.06% H2O2/PBS, pH 7.3)에 약 3∼5분간 담구어 발색반응을 시켰다. 염색이 끝난 조직은 증류수로 수세 후 탈수 및 탈지과정을 거쳐 봉입한 후 광학현미경(Olympus)으로 관찰하였다.
결과
시간경과에 따른 HSP 72 발현의 변화
소음자극 후 HSP 72에 대한 면역반응은 정상 대조군과 자극 후 2시간 경과 후에는 발현되지 않았으나 자극 후 4시간 경과 후부터 약한 면역반응이 관찰되기 시작하여 6시간 경과 후에 면역반응이 강하게 나타났으며 모두 세포질에서만 관찰되었다(Fig. 1).
시간경과에 따른 HSF-1 발현의 변화
HSF-1에 대한 면역반응은 정상에서 세포질과 핵에서 관찰되었으며 2시간 경과 에서도 동일한 소견을 보였다. 소음자극 4시간 경과 후에는 면역반응의 발현이 핵에서만 관찰되었으며, 6시간 경과 후에는 핵에서의 강한 면역반응은 약화되고 주로 세포질에서 관찰되었다(Fig. 2).
HSP와 HSF 1의 발현양상 비교
소음자극 4시간 경과 후 HSF-1가 핵에서 면역반응을 보이면서 HSP 72는 세포질에서 관찰되었고, 6시간 경과 후 HSP 72의 발현이 증가되면서 HSF-1는 면역반응의 분포가 세포질로 이동되었다(Table 1).
고찰
소음을 비롯한 여러 가지 자극에 의한 청력장애는 청각기관의 생리적, 형태적인 변화에 기인한다고 믿어지고 있으며,10) 지금까지 소음성 난청에 대한 연구는 주고 청각에 관여하는 감각세포의 형태학적 또는 기능적 변화에 초점을 두고 이루어져 왔다.
최근 분자생물학의 발달로 세포의 항상성(homeostasis)과 기능의 보존이 세포내의 여러 작용물질에 관심이 고조되고있다. 모든 생물체와 세포가 열에 노출되었을 때 나타나는 생리적 반응을 열충격반응(heat shock response)이라 하는데, 이러한 현상은 열자극에 노출된 초파리에서 염색체의 부풀림(puffing)을 관찰하면서 처음 기술되었다.11) 열자극에 의한 염색체의 부풀림은 특정 단백질의 합성에 의한 것으로, heat shock protein(HSP)이라 명명되었다.12) HSP의 기능은 완전히 밝혀지지는 않았지만 자극을 받은 세포는 물론 자극이 없는 정상세포에서도 그 기능을 하는 것으로 알려지고 있다. 즉 정상세포에서는 다른 단백질을 동반하는 역할을 하고, 단백질의 경막이동(transmembrane transport)에 도움을 주며 또한 자극을 받은 세포에서는 자극으로부터 세포가 회복하는데 도움을 주고 더 큰 자극으로부터 세포의 손상을 막는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.13)14)
HSP는 분자량에 따라 HSP 60족, HSP 70족, HSP 90족과 저분자량의 HSP 20족과 고분자량의 HSP(83, 90, 110 kDa) 등이 알려져 있으며 이중 가장 많이 연구되고 중요하게 생각되는 HSP는 HSP 70족으로 여기에는 두가지 대표적인 단백질로는 HSP 72와 HSP 73이 있다. HSP 72는 유발형(inducible form)으로 강한 자극 후에 생성되며, HSP 73은 구성형(constitutive form)으로 자극이 없는 정상세포에서 관찰된다.7)
이과영역에서 HSP 72의 연구는 와우세포에서 과연 이 단백질이 보호역할을 하느냐 하는 것인데, Lim 등3)은 귀에서 105 dB의 소음을 준 후 HSP 72가 외유모세포에 선택적으로 발현되는 것을 보고하여 HSP 72가 아마도 소음에 대한 보호작용을 할 것으로 추측하고 있다.3)
본 연구결과에서 나타난 소음자극에 따른 HSP 72의 발현변화는 정상대조군과 자극 후 2시간 때에서는 관찰되지 않은 반면, 소음자극 후 4시간에서 면역염색반응을 나타내었으며 6시간에서 그 강도가 증가하였다.
이러한 결과는 HSP 72의 방어기능이 자극의 처음 시작부터 작용(initial protection)하기 보다는 자극에 의하여 악화된 기능의 회복과정(restoration of function)에 관여한다고 추측할 수 있다.
HSP의 작용과 함께 그 발현과정에 대한 연구가 관심의 대상이 되고있다. HSF(heat shock transcription factor)는 현재까지 밝혀진 유일한 HSP의 발현조절인자이다.15-17) HSF에는 HSF-1, HSF-2, HSF-3와 HSF-4 네 가지가 존재 하는데 HSF-1은 온도상승, 중금속, 아미노산 유사체나 산화자극에 의하여 활성화되는 반면 HSF-2는 hemin에 의하여 유도된 erythroleukemia 세포의 분화과정이나 쥐의 spermatogenesis 과정에서 활성화되며, HSF-3와 HSF-4는 이와 같은 상황에서 활성화되지 않는 것으로 알려져 있다.18-20)
자극이 없는 상태에서 HSF-1은 세포질과 핵에서 monomer의 형태로 70 kD의 분자량을 존재하며 이때에는 DNA 결합능이 없다. 열충격이나 다른 생리적 자극이 가해지면 HSF-1은 trimer 형태로 결합하게 되고 핵 내에 축적된다. DNA 결합능을 가진 HSF-1은 핵 내에서 heat shock element(HSE)와 결합하고 인산화 과정을 거쳐 열충격 유전자의 전사가 활성화되면서 HSP 72를 합성하고 HSF-HSP complex를 형성한다.8)9) 자극이 지속되거나 자극이 사라지면 HSF-1의 전사능은 약화되면서 DNA 결합능이 없는 monomer의 형태로 돌아오게 된다.
본 연구에서 HSF-1은 정상세포와 소음자극 후 2시간에서는 세포질과 핵에서 면역염색반응을 보였으며 4시간과 6시간 후에는 각각 핵과 세포질에서만 면역염색반응을 나타내었다. 이러한 결과는 HSF-1의 분자량의 변화와 세포 내 조절기전에 기인하는 것으로 생각된다.
Dingwall 등21)은 자극을 받지 않은 정상세포에서 HSF-1과 HSF-2는 70 kD의 분자량을 갖는 monomer의 형태로 존재하는데, 이는 핵막을 통과할 수 있는 정도의 크기라고 하였으며, 또 다른 가능성으로는 일시적으로 핵 안으로의 이동에 관여하는 어떠한 단백질과의 관계를 제시하고 있다. 최근 연구에서는 70 kD의 HSP가 핵 내로의 이동에 관여한다고 하여 HSP 70족이 HSF-1의 분포에 영향을 미치는 것으로 보고하고 있다.22)
HSF-1의 활성은 HSP 72와 밀접한 관계가 있는 것으로 생각되며, Abravaya등23)의 연구에서 세포질 추출물에 HSP 72을 외부에서 첨가하면 in vitro에서 HSF-1의 활성을 방해한다고 보고하고 있다.
본 연구에서 소음자극 4시간 경과 후 HSF-1이 핵에서 강하게 발현되는 것은 자극으로 인하여 HSF-1이 활성화 되고 DNA 결합능을 가지게 되면서 핵 내의 HSE와 결합하고 이와 함께 HSP 72를 합성하는 것으로 생각되며, 소음자극 후 6시간째 HSF-1이 세포질에서 강하게 발현되는 것은 HSP 72의 증가와 함께 HSF-1의 활성이 저하되고 DNA 결합능이 없는 monomer의 형태로 전환되면서 세포질로 이동하여 나타나는 것으로 추측된다.
이상의 결과로 보아 소음자극 후 HSP 72의 발현과 HSF-1의 발현은 서로 밀접한 관계로 조절과 생성에 관여하는 것으로 생각된다.
결론
흰쥐의 와우에서 HSF-1은 정상대조군의 세포질과 핵에서 관찰되었으며 소음자극 후에는 세포 내에서의 발현부위가 변화하였다. HSP 72는 HSF-1이 핵 내에 주로 발현된 자극 후 4시간에 나타나기 시작하여 6시간 후에는 더욱 강한 면역반응을 나타내었다. 이러한 분포로 보아 와우에 손상을 초래할 수 있는 강한 소음자극에 대하여 정상적으로 존재하는 HSF-1은 DNA 결합부위에 결합하여 와우의 손상에 대한 방어작용에 관여한다고 알려진 HSP 72의 생성을 유도하는 것으로 생각되며, HSF-1의 존재를 확인 함으로서 HSP 72 생성의 촉진 및 억제 등을 이용한 청각기관에서의 역할에 대한 연구에 도움이 될 것으로 사료된다.
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