The Effect of Cis-Retionic Acid on Culture of Aural Cholesteatoma Keratinocytes

Kim, Young Do; Pyo, Si Young; Hong, Nam Pyo; Ahn, Hwoe Young; Cha, Chang Il; Song, Young How

Original Article

Middle Ear Diseases

Korean Journal of Audiology 2000;4(1):44-55.

The Effect of Cis-Retionic Acid on Culture of Aural Cholesteatoma Keratinocytes

Young Do Kim, Si Young Pyo, Nam Pyo Hong, Hwoe Young Ahn, Chang Il Cha, Young How Song

Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyung Hee Universisity, Seoul, Korea

중이 진주종 각질형성 세포의 증식과 분화에 미치는 Cis-Retinoic Acid의 영향

김영도^, 표시영^, 홍남표^, 안회영^, 차창일^, 송영호

경희대학교 의과대학 이비인후과학교실

Abstract

Retinoids have recently become of interest to clinicians because of their ability to inhibit migration and proliferation of premalignant squamous cells while enhancing growth and proliferation of normal cells. Aural cholesteatoma is defined as hyperproliferative keratinocytes in middle ear cavity. Although Cholesteatoma is not premalignant, it exhibits locomotive and osteodestructive behaviors which are characteristic to neoplasm. Cis-retinoic acid (c-RA) is a naturally occurring metabolite of retinol. An in vitro investation was undertaken to determine whether c-RA exhibit similar effects on proliferation and differentiation of cholesteatomatous cell culture, which obtained during operation, comparing with the effect of c-RA on cultured normal keratinocyte. First, in view of proliferation, cholesteatomatous and normal keratinocyte were cultured on well plate of Green's medium, treated with 0, 10^-9 M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M concentration of c-RA. These well plate were harvested respectively at 2, 4, 7, 9 culture day and cell counts was done by hematocytometry. Second, in view of differantation choleateatomatous and normal keratinocytes were cutured in Green's medium for 9 days enhancing 3-dimensional cuture. In this investigation, c-RA has an significant inhibitory effect on cholesteatoma proliferation and enhancing effect on cholesteatoma differentiation. This results suggest that retionoids may have a role in controlling cholesteatoma disease.

Keywords: Cholesteatoma;Proliferation;Differentiation Cis-retionic acid.

교신저자：홍남표, 130-702 서울 동대문구 회기동
전화) (02) 958-8474, 전송) (02) 958-8470, E-mail) KHUENT@UNITEL.CO.KR

서 론

중이 진주종이란 점막으로 구성된 중이강내에 각화된 편평상피가 축적되어 종괴를 형성하는 것을 말하며, 주위의 골 조직을 파괴함으로써 심각한 합병증을 유발하여 근치적인 수술요법을 필요로 하고 약물치료 등의 보조적 방법으로는 치료가 되지 않는 난점을 가지고 있다.
진주종은 조직학적으로 피부조직과 유사하게 각질형성 중층편평상피로 맨 아래쪽부터 기저층, 극상층, 과립층, 각질 층의 네 층으로 되어있는 기질(matrix)과 상피하 결체조직인 주변기질(perimatrix)로 구성되어 있다.^1-3)
중이 진주종의 발생기전에는 아직도 많은 논란이 있으며 임상적으로 여러 유형의 진주종이 각각 다른 발생기전으로 설명되고 있다. 즉 중이점막이 각질화 편평상피로 화생(metaplasia)한다는 설, 고막 천공을 통해 외이도 상피가 중이로 이동한다는 설, 이관부전 등에 의한 고막의 함입낭(retraction pocket)이 진행되어 진주종이 형성된다는 설, 편평상피의 기저층세포가 기저막을 뚫고 과증식이 된다는 설 및 선천적으로 중이강내에 편평상피가 잔류하여 생긴다는 여러 가설이 있다.⁴⁾⁵⁾
진주종의 병인에 대한 면역조직화학적 연구결과로 Wullstein 등⁶⁾이 진주종에서 기저세포의 증식이론을 제시한 이래 증식능력을 가진 기저세포 수의 증가를 확인하였고 기저세포와 인접하고 있는 기저상부세포의 증식능력이 상실되지 않고 남아 있음이 밝혀졌으며⁷⁾⁸⁾ 진주종의 과각질화 현상은 기저세포와 기저상부세포의 과다증식으로 인한 것으로 알려져 있다.⁹⁾
Cis-retinoic acid(이하 c-RA로 약함)는 retinol(Vitamin A)의 자연적인 대사물로 세포의 분화, 증식, 그리고 배아의 발달에 미치는 영향에 대한 많은 연구가 되어 왔는데 이상 각화증의 치료에 유용성이 보고되어 왔으며, 전암성 편평세포의 이동성과 증식성을 억제하면서 정상 편평세포의 성장과 증식을 촉진시키는 능력이 있는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾
또한 c-RA는 최근 악성종양의 예방과 치료에 대한 잠재적인 역할로 주목받고 있는데 이는 c-RA의 전암성 편평 상피 세포의 증식억제 기능과 세포의 이상분화를 억제하는 기능에 기인하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾
체외에서 배양한 각질형성세포의 성장과 분화에 미치는 c-RA의 효과에 대한 연구는 단층 배양한 각질형성세포를 사용하여 이미 많이 이루어진 바 있으나¹²⁾¹³⁾ 진주종에 대한 c-RA의 영향을 연구한 보고는 미미하다.
진주종은 신생물은 아니지만 효소에 의한 골파괴¹⁴⁾와 이동성 등¹⁵⁾ 신생물에 흔한 특성을 공유하고 있으며 c-RA는 정상 각질형성세포의 증식과 성장은 촉진시키면서 전암성 각질형성세포의 이동과 증식은 억제하는 능력이 보고되어 있는데,¹¹⁾ in vitro에서 c-RA가 중이 진주종배양에 미치는 영향을 연구한 보고는 진주종의 이동성(en mass migration)에 미치는 영향에 관한 것으로 제한되어 있었으며,¹¹⁾¹⁶⁾ c-RA가 진주종 기질세포의 증식과 분화에 미치는 영향을 분석한 연구는 문헌상 찾아볼 수 없었다.
이에 본 연구에서는 c-RA가 진주종 기질 각질형성세포의 증식과 분화에 미치는 영향을 분석하고자 정상 신생아에서 채취한 포피와 진주종 기질의 각질형성세포를 각기 다른 c-RA의 농도의 상태에서 배양하여 증식과 분화라는 두 측면에서 비교 분석하였으며, 또한 진주종의 국소적 치료제로서 c-RA의 이용가능성을 모색하고 진주종 증식 억제에 필요한 적정한 c-RA의 농도를 알아보고자 이 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대상 및 재료

정상 대조군은 신생아 포피 제거술 시 얻어진 포피조직을 이용하였으며 실험군은 1999년 6월부터 2000년 2월까지 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과에서 진주종성 중이염으로 수술 받은 환자에서 수술시 채취한 진주종 조직을 대상으로 하였다.
각질형성세포의 동정 및 분화지표는 분화된 각질형성세포에서 발현되는 cytokeratin에 대한 mouse anticytokeratin 34βE12(Enzo Diagnostics, Inc., NY, USA)와 involucrin에 대한 rabbit anti-human in-volucrin(Biomedical Technologics Inc., Stoughton, MA, USA)을 이용하였다.

방 법

세포 배양

포피 상피의 각질형성세포 배양
대조군으로 신생아 포피제거술시에 얻어진 포피를 실험실로 옮겨 진피층을 가능한 많이 제거하고 조직을 1 mm³ 크기로 만들어 0.05% trypsin-0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid(Gibco BRL Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA, 이하 trypsin-EDTA)용액에 부유시켜 37°C, 5% CO2 배양기에서 90분간 방치하였다. 여기에 소량의 fetal bovine serum을 첨가하여 trypsin 활성을 제거한 후 시험관에 옮기고 진탕기에서 1~2분 진탕하여 낱개의 세포가 유리되도록 하였다. 유리된 세포는 phosphate buffered saline(이하 PBS라 약함)으로 2~3회 세척한 뒤 Medium 154(Cascade Biologics Inc., Portland, Oregon, USA, 이하 M154) 무혈청 배양액으로 배양하였다. 세포가 90%정도의 단층을 형성하면 대기에 노출시켜 계대 배양하였다.

진주종 기질의 각질형성세포 배양
진주종 수술시 채취된 진주종 조직을 PBS 용액에 담아 즉시 실험실로 옮겨 penicillin G sodium 100 U/ml, streptomycin sulfate 100 μg/ml, amphotericin B 0.25 μg/ml가 첨가된 PBS용액으로 3~4회 세척하였다. 세척된 조직에서 각질층을 가능한 제거한 후 trypsin-EDTA 용액에 넣어 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 60분간 방치하였다. 여기에 소량의 fetal bovine serum을 첨가하여 trypsin활성을 제거한 후 Green 배양액에서 정상 피부세포의 배양과 같은 방법으로 배양 하였다.

포피 및 진주종 기질의 각질형성세포의 증식과 분화에 미치는 c-RA의 영향 분석

포피 및 진주종 기질의 각질형성세포의 증식 배양과 c-RA의 처리
정상 포피 조직 및 진주종 조직으로부터 초대 배양된 각질형성 세포가 90% 이상의 단층을 형성하면 Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 낱개의 세포를 유리시키고 정상 상피 세포는 3.8×10 5/3 ml, 진주종 상피 세포는 5×10 4/3 ml의 농도가 되도록 Green 배양액에 부유하였다. 이들 세포를 각각의 well plate에 3 ml씩 분주하여 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하여 세포를 바닥에 부착 시켰다. 24시간후 각 well로부터 배양액을 제거하고 c-RA를 각각 10^-9M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M를 투여 한 군과 c-RA를 투여하지 않은 군으로 나눠 Green 배양액으로 교체하여 9일간 배양하였고 배양액은 매 2일마다 교환하였다. 결과는 배양 2, 4, 7 및 9일 째에 각 농도의 well plate에서 세포를 수확하여 혈구계산판(hematocytometry)에서 세포수를 측정하였다. 동일한 배양 시기에 있어서 RA의 농도에 따른 증식의 차이는 배양 채취 시간별로 Wilcoxon-Rank Sum test의 통계 방법을 이용하여 각 농도별 비교 분석하였고, 포피와 진주종 기질의 각질형성상피의 증식배양의 비교분석은 Repeated Measures of ANOVA를 이용한 통계분석을 이용하였다.

포피 및 진주종 기질의 각질형성세포의 분화 배양과 c-RA의 처리
정상 포피 및 진주종 기질로부터 초대 배양(primary cultured)된 각질 형성 세포를 수확한 다음 포피 및 진주종 기질의 각질형성세포를 Green 배양액에 일정한 농도가 되도록 조절한 다음 각 well plate당 1 ml 씩 분주하여 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 단층을 형성할 때까지 배양하였다. 세포가 단층을 형성하면 배양액을 제거하고 c-RA가 10^-9M, 10^-8M, 10^-7 M, 10^-6M, 0 등의 농도별로 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배양액으로 교체하여서 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 9일간 배양하였다. 이에 세포의 증식과 더불어 단면 배양에서 점차 3차원적 입체 배양으로 유도되면서 세포의 증식과 분화를 유도하였다. 배양액은 주3회 교체하였고, 9일간 배양이 끝나면 배양액은 제거하고 Dispase 용액(Boehringer Mannheim, Cat # 1276p21, Sandhofer, Strasse 116, D-68305, Mannhenn, Germany)을 처리하여 표피층을 분리시켰다. 분리된 표피조직을 10% 중성 formalin에 고정하였다.

c-RA에 처리되어 배양된 포피 및 진주종성 기질의 각질형성세포 조직의 면역조직화학적 및 H-E 염색
배양된 대조군 및 실험군의 조직들은 배양액에서 구조적 변형이 없도록 조심스럽게 들어내어 10% neutral formalin 용액에 고정하여 파라핀포매 후 6 μm의 두께로 연속절편을 작성하여 gelatin 처리된 슬라이드에 붙인 후 일부는 hematoxylineosin 염색하여 형태학적 관찰을 시행하였고 나머지 조직절편들은 다음과 같은 과정을 거쳐 각질형성세포임을 증명하며 또한 세포 분화 지표로 사용되는 cytokeratin과 involucrin에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였다.
xylene으로 탈파라핀화 한 후 100%, 90%, 80%의 알콜과 증류수로 연속적으로 함수시켰다. 내인성 과산화 효소의 반응을 억제시키기 위하여 3% hydrogen peroxide에 15분간 반응시켰으며 cytokeratin 염색은 pepsin으로 15분간 처리하였다. 이후 Tris 완충액으로 5분간 2회 세척 후 cytokeratin에 대한 일차 항체는 mouse anticytokeratin 34βE12(Enzo Diagnostics, Inc., NY, USA)을, involucrin에 대한 일차 항체는 rabbit anti-human involucrin(Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA, USA)을 1시간 동안 반응시킨 후 Tris 완충액으로 5분간 2회 세척하였으며 Large Volume DAKO LSAB^®Kit(DAKO Corporation, CA, USA)를 이용하여 발색을 유도한 후 diaminobenzidine(DAB, Sigma, USA)시약으로 10분간 처리하였고 1분간 Harris hematoxylin염색으로 대조 염색하였다.

결 과

포피 및 진주종 기질의 각질형성세포의 증식에 미치는 c-RA의 영향

포피의 각질형성세포 증식 배양시 처리된 10^-9M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M, 0의 c-RA의 각각의 농도에 대하여 배양 2일, 4일, 7일, 9일째에 well plate에서 채취한 세포 배양체를 혈구계산판(hematocytometry)을 이용하여 각각의 세포수를 확인하여, 동일한 배양 시기에 있어서 RA의 농도에 따른 증식의 차이를 배양 채취 시간별 Wilcoxon-Rank Sum test를 이용하여 비교 분석하였다. 배양 결과 2일째부터 모든 농도에서 증식 속도가 억제되었으나 시간이 경과할수록 10^-6M 농도에서 현저하게 세포 증식속도가 억제되었으며, 10^-9M, 10^-7M, 10^-8M의 순으로 증식속도가 다소 억제되었으나 10 -6M에만 통계적으로 의미 있게 증식속도가 억제되었다(Fig. 1).
진주종 기질의 각질형성세포 배양 검사도 상기 방법과 같은 방법을 통하여 분석한 결과 2일째는 차이가 없었으나 시간이 경과할수록 RA의 농도에 비례하여 현저히 증식 속도가 억제되었으며 10^-6M의 농도에서는 배양 3일째부터 점차 소멸되어 배양이 불가능하였다. 그러나 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M의 순으로 증식속도가 억제되어 10^-7M에서 가장 현저히 증식 속도가 억제되었고 in vitro에서 진주종 증식 억제에 적절한 농도로 판단되어졌다(Fig. 2). 또한 포피 및 진주종 기질의 각질형성세포의 배양시간별 억제 능력은 Repeated Measures of ANOVA를 이용한 통계 분석에 있어서 진주종 기질의 상피세포의 증식이 의미 있게 억제되었음을 보여 주었다.

포피 및 진주종 기질 각질형성세포의 배양 소견

포피 및 진주종 기질의 각질형성세포의 배양층에 대하여 H-E 염색과 면역조직화학적 염색을 시행하여 다음과 같은 소견을 관찰하였다.

H-E 염색

포피의 각질형성세포 세포배양에서는 c-RA를 처리하지 않은 군에서는 상부의 각질형성세포층은 기저세포층, 유극세포층, 과립구층, 각질층의 구분이 명확하지는 않지만 어느 정도 구분을 보여 주고 있으나 정상 피부에서 보이는 rete ridge는 관찰되지 않았다(Fig. 3A). 배양세포는 4~6개의 세포층으로 형성되었으며 세포핵의 모양이 다양하게 나타났다. 10^-9M에서 10^-6M 사이의 농도의 c-RA를 배양액에 첨가하였을 때 과립층이 점차 소실되고 각질층 하부가 느슨해지는 것이 관찰되었다. 또한 농도가 증가할수록 층의 소멸로 인한 두께의 감소와 함께 각층의 구분이 힘들었다(Fig. 3B and C).
진주종 기질 각질형성세포의 배양에서는 c-RA를 처리하지 않은 군과 10^-9M, 10^-8M 등을 처리한 군에서는 기저세포층, 유극세포층, 과립구층, 각질층의 구별이 힘들고 형태적으로는 다양한 형태의 유핵세포들이 관찰되었으며 각질형성세포로 판단하기 힘든 모양이었다(Fig. 4A). 그러나 10^-7M에서는 형태적으로 정상 각질형성세포와 유사한 모양이었으며 1~3개의 세포층으로 형성되어 있었고 형태상으로 상층으로 갈수록 각질형성 세포분화가 증진되었는지는 판단하기가 힘들었다(Fig. 4B).

면역조직화학적 염색

Cytokeratin
포피의 각질형성세포(Fig. 5A, B and C)와 진주종 기질의 각질형성세포(Fig. 6A and B) 모두에서 거의 모두 cytokeratin에 대한 염색에 양성인 세포층으로 구성되어 있음을 확인함으로서 각질형성세포로 구성되었음을 나타내었다.

Involucrin
상기 cytokeratin의 염색 소견과 마찬가지로 포피세포의 각질형성세포(Fig. 7A, B and C)와 진주종 기질의 각질형성세포(Fig. 8A and B) 모두에서 각질형성세포의 중간 분화단계 표식자인 involucrin에 일부 세포층에서 염색되어 각질형성세포로 구성되었음을 나타내었고 세포 분화도의 차이를 확인할 수 있었다.

c-RA의 포피 및 진주종 기질의 각질형성세포 분화에 미치는 영향의 비교

포피의 각질형성세포 배양에서는 H-E 염색상 c-RA을 처리하지 않은 포피 각질형성세포에서는 기저세포층, 유극세포층, 과립층, 각질층 등의 명확한 구분은 안되나 상측으로 갈수록 각질이 증가하고 하측으로는 다수의 유핵세포로 구성된 여러층의 기저 세포층이 관찰되고 있다. 10^-8M, 10^-7M의 c-RA에서는 각질층의 하부가 느슨해지고 10^-6M에서는 기저층 상부에서부터 핵을 가진 세포들이 느슨하게 배열되어 있었다(Fig. 3A, B and C).
Involucrin은 c-RA을 처리하지 않은 대조군과 10^-9 M에서는 기저 세포층을 제외한 일부 유극세포층, 과립세포층에서 염색되었고, 10^-8M에서는 점차 염색이 과립세포층과 기저층까지 넓게 염색되었다(Fig. 7A and B). 10^-7M, 10^-6M에서는 기저세포층에서 더 강하게 염색되며 상부에서도 일부 느슨해진 각질층까지 involucrin이 넓게 염색이 되었다(Fig. 7C).
Cytokeratin은 c-RA을 처리하지 않은 군과 10^-9 M, 10^-8M 등에 비해 10^-7M, 10^-6M으로 갈수록 각질층에서 기저층까지 핵을 가진 세포들에서도 염색되었으나 각질층의 감소로 층의 두께는 감소한 소견을 보였다(Fig. 5).
진주종기질의 각질형성세포 배양에서 c-RA을 투여하지 않은 군과 10^-9M 농도로 투여한 군에서는 정상 각질 상피 세포처럼 기저층에서 각질층으로의 분화된 형태는 찾기 힘들었고 다양한 형태의 다수의 유핵세포의 미성숙한 형태로 관찰되었다. 그러나 10^-7M 농도에서는 상층으로 갈수록 각질세포의 분화된 층을 보여주지는 않았지만 각 세포의 형태가 정상 각질세포의 편평 상피의 형태를 갖추고 있었다(Fig. 4).
면역조직화학적 염색에서도 진주종 각질형성세포 배양에서 c-RA을 투여하지 않은 군과 10^-9M c-RA을 투여 한 군에서는 다수의 유핵세포에서 cytokeratin 및 involucrin에 대한 염색이 됨으로써 각질상피세포임을 확인하였으나 진주종기질의 각질형성세포의 3차원 입체 배양의 어려움으로 인해 상층으로 갈수록 진주종 기질세포의 각질형성, 형태적 분화 및 면역조직학적 염색으로 확인하지는 못하였다. 그러나 c-RA 10 -7M 농도에서 배양된 진주종 세포의 경우 각질세포의 분화의 지표인 cytokeratin 및 involucrin의 염색이 양성인 세포가 증가되었으며 각 유핵세포의 형태도 편평상피세포와 유사한 모양으로 관찰되었다(Figs. 6 and 8).

고 찰

진주종의 상피는 정상 표피보다 상피층이 얇고 표피층이 감소되어 있으며 각질층이 두껍고 일부에서는 각질층에 핵이 발견되기도 하는데 이는 그 상피층이 병적으로 과도한 증식을 하고 있음을 의미하는 것으로 생각된다.
정상 피부 기저층의 기저세포는 증식능력을 가지고 있어 새로이 생성된 세포는 기저막을 통과하며 기저상층으로 이동하면서 분화되어 각질층에 도달하여 상피세포는 궁극적으로 각질층으로 떨어져 나가게되는데 이러한 분화와 증식이 균형을 이루어 상피세포층을 유지하게 된다. 즉, 세포분화는 항상 세포증식과 상반된 보완관계를 유지하며, 세포의 증식도가 증가하게 되면 분화는 미분화상태로 남게 된다. 소위 상피세포의 항상성이 이러한 양자간의 균형에 의해서 유지되나 만약 그 균형이 깨어지면 세포의 과증식 경향이나 분화의 가속현상이 기저상층에서 나타날 수 있다.¹⁷⁾
정상상피에서는 증식과 분화의 균형이 자가분비와 측분비를 통한 성장촉진과 성장억제 및 분화조절인자에 의해 유지된다.¹⁸⁾ 이러한 인자의 생성이나 활성화의 변화로 과증식이 발생될 수 있고 건선의 경우 TGF-α(transforming growth factor-alpha)와 interleukin-6의 증가가 과증식 반응에 관여되는 것으로 보고되었는데¹⁹⁾ 이와 유사한 기전이 진주종에서도 관여하여 증식과 분화의 균형이 깨어져 세포의 과증식 경향으로 진주종 상피세포에서의 과도한 각질형성이 발생되리라 생각된다.
이에 대한 면역조직화학적 연구결과를 종합해 보면 먼저 진주종의 과증식 성향에 대한 연구에 있어서 Wullstein 등⁶⁾이 진주종에서 기저세포의 증식이론을 제시한 이래 증식능력을 가진 기저세포 수의 증가를 확인하였고 기저세포와 인접하고 있는 기저상부세포의 증식능력이 상실되지 않고 남아있음을 cytokeratin,⁷⁾ PCNA(proliferation cell nuclear antigen)²⁰⁾ cytokine⁸⁾ 등을 통한 면역조직화학적 연구에서 확인하였다. 그리고 진주종 상피에서 특징적으로 보여지는 과각질화 현상은 기저세포와 기저상부세포의 과다증식으로 인한 것으로 알려져 있으며,⁹⁾ Stammberger 등²¹⁾은 involucrin과 filaggrin 분화인자를 이용한 면역조직화학적 연구에서 기저상부세포의 조기분화(early differentiation)를 확인하였다. 본 연구에서 편평상피세포의 분화 표식자로 사용된 anti-cytokeratin34βE12는 분화된 편평상피세포의 기저상부층에서 각질층까지 염색되는 것으로 알려져 있다.²²⁾ 본 연구의 중이 진주종 기질세포의 배양에서도 전반적으로 넓게 염색되는 소견을 보여 편평상피세포가 배양되었음을 확인할 수 있었다.
Involucrin은 Rice와 Green²³⁾에 의해 처음으로 규명되어 졌으며 인체의 편평상피에서 합성되는 일종의 세포질 단백으로서 인체 중층편평상피의 성숙과정에 있는 세포는 원형질막의 세포질면에 약 12 nm 두께인 단백기낭(protein envelope)을 형성하는데 involucrin은 이 단백질의 수용성 단백 전구물질이다. 분자량이 140 kD의 비교적 고분자량의 세포질 단백으로써 인간의 정상표피에서는 과립층과 상부극세포층의 각질형성 세포에서 발견되고 기저층과 각질층에서는 대개 발견되지 않으므로 편평상피 세포의 중간단계 분화(intermediate stage of squamous differentiation)에 대한 좋은 지표로 사용되어지고 있다. 정상 피부에 대한 involucrin의 반응에 관한 연구에서 Murphy 등²⁴⁾은 표피의 상부 1/3에서 세포질이 균일하게 염색되었고 기저각질세포와 극세포층의 직상부층은 염색이 안 된다고 보고하였다. Stammberger M, Jeus Bujia 등²¹⁾은 진주종에서 표피의 빠른 증식 표식자로 알려진 keratin 16의 발현이 외이도 피부보다 분명히 증가되었고 증식능력과 밀접한 관련성을 갖는 very late anti-gens-3(VLA-3)가 정상표피에는 발현되지 않지만 진주종 세포에서는 발현이 증가되어 진주종에서 증가된 증식성을 확인하였다. 또한 각질형성세포의 최종 분화의 표식자인 Trop-2가 진주종에서 정상피부보다 약하게 발현되어 결국 진주종에서 정상적인 증식과 분화의 균형에 장애가 있음을 보고하였다.
In vivo와 in vitro에서 표피의 각질형성세포의 증식과 분화는 몇몇 펩타이드 성장인자 즉, 칼슘이온, phorbol esters, retinoids, cytokines 등 다양한 요인들에 영향을 받는 것으로 알려져 있으며²⁵⁾ 경험적으로 retinoid는 상처치유에 중요한 작용을 하리라 생각되어져 왔으며 당단백질 생산에 중요하고 세포막의 당-인산염 화합물의 통과에 수송체로 작용하는 것으로 알려져 있다.²⁶⁾
c-RA는 스테로이드와 갑상선과 같은 계열의 RAR-α, RAR-β, RAR-γ(retinoic acid receptor-gamma)로 명명된 핵내에 위치한 수용체에 작용함이 밝혀졌으며²⁶⁾ 이를 통해 생물학적 작용이 나타나는 것으로 알려져 있는데 인체 표피 각질형성세포의 증식에 대하여 촉진 혹은 억제작용을 가진 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ 또한 retinoid는 전암성 편평세포의 이동과 증식을 억제하면서 정상세포의 성장과 증식을 촉진시키는 역할로 최근 임상적 관심이 모아지고 있다.¹⁰⁾
진주종은 신생물은 아니지만 효소에 의한 골파괴¹⁴⁾와 이동성 등¹⁵⁾ 신생물에 흔한 특성을 공유하고 있으며 c-RA는 발암 전구물질을 대사시키는 여러 가지 약물대사 효소의 활성도와 유전자 발현을 증가시킴으로써 암발생 유전자의 발현을 억제하여 악성종양의 예방과 치료에 대한 잠재적인 역할이 기대되고 있다.¹⁰⁾
c-RA는 in vivo와 in vitro에서 표피 각질형성세포의 분화와 증식에 뚜렷한 영향을 있음이 보고되어 왔지만 작용기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. c-RA의 각질형성세포에 대한 증식 조절작용은 각질형성세포에 직접적인 작용과 진피나 염증세포에서 생성되는 성장조절인자의 측분비량의 변화에 의한 간접적인 작용이 작용하리라 생각되어진다.¹⁸⁾
체외에서 배양한 각질형성세포의 성장과 분화에 미치는 RA의 효과에 대한 연구는 단층 배양한 각질형성세포를 사용하여 이미 많이 이루어진 바 있지만,¹³⁾ 중이 진주종에 대해서는 c-RA의 영향에 대한 연구가 미미하였는데 이는 진주종의 배양이 시료채취한 양의 제한, 감염의 동반 및 진주종세포에 적절한 환경조성의 어려움이 있었기 때문이다.
본 연구에서는 진주종 채취시 골조직에 부착된 기질부위가 최대한 확보되도록 하여 제한된 시료의 양으로 인한 배양실패를 줄이도록 하였고 중이 진주종에 흔히 동반되는 감염으로 인한 세균의 오염을 방지하기 위해 조직배양시 penicillin 100 IU/ml, streptomycin 100 μg/ml, amphotericin-B(Fungizone^®)가 첨가된 PBS용액으로 3~4차례 세척하여 감염으로 인한 배양실패를 줄이도록 하였는데 이는 Proops 등²⁷⁾이 사용한 방법과 같다. 또한 각질형성세포의 선택적 배지인 Green배양액에 정상 상피 세포와 진주종기질의 각질형성세포를 배양하여 각각 다른 농도의 c-RA를 처리하여 세포 배양을 하여 세포의 증식을 확인하였다. 또한 세포 분화에 치는 영향을 알아보기 위해 각각 다른 c-RA의 농도의 DMEM배양액에서 각질 세포의 다층 형성을 유발하여 삼차원적 입체 배양에서 세포 분화에 미치는 영향을 분석하였다.
문헌상 in vitro에서 진주종세포의 배양에 미치는 c-RA 영향에 관한 보고는 주로 진주종에서 특징적으로 나타나는 이동성에 관한 것으로, Minotti 등¹¹⁾¹⁶⁾은 진주종의 이동성이 c-RA투여로 억제됨을 관찰하여 진주종 상피세포의 adhesion의 감소²⁸⁾와 cytoskeleton의 변화¹¹⁾ 두 가지의 기전이 진주종의 이동성을 억제하는데 관여할 것으로 보고하였을 뿐 진주종성 편평 각질형성세포의 증식이나 분화에 미치는 영 향을 언급하지는 않았다.
c-RA는 정상 각질형성세포에서 배양한 각질형성세포에 대하여 증식을 촉진시키고 분화는 억제한다고 알려져 있다.²⁹⁾ 10^-5M 농도의 c-RA의 각질형성세포를 배양시 5일후 각질형성세포가 괴사되었으며 10^-7M농도와 10^-6M농도의 c-RA에 배양시 계속적인 증식을 보였고 전자현미경 관찰상 c-RA는 각질형성세포의 세포간 접착을 약하게 하는 형태변화를 초래하였으며 교소체 단백의 생성을 감소시켰음이 보고되었다.²⁸⁾ 그러나 본 실험에서는 c-RA가 포피 각질형성세포의 증식 배양에 미치는 영향으로 10^-6M 농도의 c-RA에서 각질형성세포를 배양시 c-RA을 처리하지 않은 군에 비교하여 통계적으로 의미 있게 증식 속도를 억제하였으며 또한 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M의 농도에서도 다소 증식 속도는 감소하였지만 계속적으로 증식되는 소견을 보였다.
진주종의 병태생리상 이동성과 함께 증식성이 병태생리에 크게 관여하리라 사료되는데 c-RA가 진주종의 증식과 분화에 미치는 영향에 대한 보고는 문헌상 찾아볼 수 없었다.
진주종의 증식성에 대해서는 c-RA는 10^-9M농도에서도 의미 있는 증식 속도 억제를 보였으며 10^-8M, 10^-7M 등의 농도로 점차 높아질수록 증식 속도 억제 효과가 농도에 비례하여 높아지는 양상이었으며 10^-6 M의 농도에서는 진주종 상피 세포의 괴사 소견을 보였다.
진주종의 분화에 대해서는 c-RA을 처리하지 않은 군과 10^-9M, 10^-8M의 농도 등에서는 H-E 염색상 세포형태는 기저층과 각질층으로 구분이 불가능한 다형태의 세포들로 형성되어 있으나 10^-7M에서는 형태적으로 편평 각질형성세포와 유사한 형태로 정확히 층이 구별되지는 않지만 1~3개의 층으로 구성되어 있었으며 기저층에서 상층으로 갈수록 분화가 촉진되는 형태적 소견은 없었다. 또한 면역 조직 검사상 각질 세포의 분화 표식자로 알려진 involucrin과 cytokeratin 대한 염색의 양성인 세포가 c-RA를 첨가하지 않은 군과 10^-9 M에 비해 10^-7M에서 증가됨을 확인함으로써 c-RA가 세포 분화를 촉진시킴을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 retinoid가 진주종의 이동성을 억제함을 보고한 기존의 연구결과와¹¹⁾¹⁶⁾ 더불어 진주중의 증식성을 의미 있게 억제하는 c-RA의 효과를 밝혔으며 앞으로 진주종의 보존적 치료제로 쓰일 수 있는 가능성을 보여주었다고 하겠다.
c-RA는 경구 투여시 치료적 약물농도에서도 기형유발 등 상당한 부작용이 나타나지만 국소적 투여할 경우 혈장의 c-RA나 대사물질의 농도 증가가 나타나지 않는 것으로 보고되어³⁰⁾ 국소 투여는 경피 투과성이 미미한 것으로 알려져 있고³¹⁾³²⁾ 전신적 부작용이 없는 것으로 알려져 있다.³⁰⁾ 따라서 c-RA의 국소 투여시 충분히 높은 농도의 이용액제제로 사용할 수 있으리라 생각된다.
또한 최근 RAR-α에 선택적으로 결합하는 adapalene(Differin^®) 등 피부에 선택적으로 작용하는 c-RA의 개발로 c-RA의 부작용을 한층 줄여주는 계기가 되어 진주종 치료제로서 c-RA의 가능성을 더 한층 높여 주었다.

결 론

1999년 6월부터 2000년 2월까지 경희대학교 의과대학 이비인후과에서 중이수술중 진주종 조직을 채취하여 증식과 분화를 위한 배양을 통하여 전암성 세포의 증식과 이동성을 억제하고 분화를 촉진하는 것으로 알려진 c-RA를 농도를 달리하여 처리함으로서 진주종의 증식이 의미 있게 억제됨과 함께 분화를 촉진하는 것을 관찰하였다.
이러한 결과는 c-RA가 진주종 세포배양의 이동성을 억제시킨다는 기존의 연구 결과와 더불어 장래 진주종성 중이염의 보조적 치료제로서 retinoic acid의 이용 가능성을 제시하였다.

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