The Effect of Cisplatin on the Calcium Regulation in Isolated Outer Hair Cells of Guinea Pig

Chung, Jong Woo; Kang, Hun Hee

Original Article

Anatomy and physiology

Korean Journal of Audiology 2003;7(1):32-37.

The Effect of Cisplatin on the Calcium Regulation in Isolated Outer Hair Cells of Guinea Pig

¹Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan, College of Medicine
²Postgraduate School, University of Ulsan
³Asan Institute of Life Science, Seoul, Korea

분리된 기니픽 외유모세포에서 Cisplatin에 의한 세포 내 칼슘이온 농도의 변화

정종우^¹^, 강훈희^{²^,³}

^¹울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
^²울산대학교 대학원
^³아산생명과학연구소

Abstract

The mechanism of cisplatin ototoxicity has been studied and there found several evidences of outer hair cell damage. Calcium plays an important role in cellular signal transduction and many studies argued that calcium channel was blocked or modified by ototoxic drug. In this study, authors aimed to know the intracellular calcium regulation by cisplatin in isolated outer hair cells and to speculate the mechanism of hearing loss by cisplatin. Outer hair cells were isolated from guinea pig by enzymatic and mechanic dissociation. Intracellular calcium was measured by Fura 2-AM fluorescent dye. Cisplatin solution (0.3 mM) was perfused in bath solution and the changes of the intracellular calcium were recorded. High-potassium induced increase of intracellular calcium ([Ca²⁺]i) was partially inhibited by cisplatin but repeated perfusion of cisplatin could increase [Ca²⁺]i even after the perfusion of nifedipine. In the absence of external calcium, [Ca²⁺]i was not changed by adding cisplatin to bath solution, but when the outer hair cells were perfused with 1 mM calcium bath solution including 0.3 mM cisplatin, [Ca²⁺]i increased. After preincubation of outer hair cells with 3 mM verapamil, cisplatin did not induce the [Ca²⁺]i increase in the presence of external calcium. And when the cells were perfused with 1 mM Ca²⁺ and cisplatin, [Ca²⁺]i started to increase. From this study, we could conclude that cisplatin deteriorate intracellular calcium regulation in outer hair cells and induce the cells dead.

Keywords: Calcium ion;Cisplatin ototoxicity;Fura-2;Signal transduction mechanism.

교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1
전화) (02) 3010-3718, 전송) (02) 489-2773, E-mail：jwchung@amc.seoul.kr

서 론

이독성이라는 것은 어떤 약제나 화학물질에 의해 청신경, 와우, 전정기관 등의 손상이 생겨서 청력과 평형기능의 소실을 가져오는 것을 의미한다. 여러 가지의 약제들이 이독성 난청을 초래할 수 있으며, 가역적인 경도의 손상에서부터 비가역적인 전농에 이르기까지 다양한 임상 형태를 나타낸다. 더욱이 이러한 약제를 지속적으로 사용할 수 밖에 없을 때 이독성 난청은 더욱 심각한 문제로 대두된다.
Cisplatin은 여러 악성종양의 치료에 쓰이는 항암제로서 DNA에 비가역적으로 반응하여 구아닌기의 나선가닥들 사이에서 상호연결을 형성하여 세포의 파괴를 가져오는 약물이다. 그러나 항암효과 이외에 이독성, 신독성 및 중추 신경계 독성 등의 부작용을 가지고 있다. 사람에게서 cisplatin 투여에 따른 이독성은 13~81%로 보고되고 있다.²⁾³⁾⁴⁾
Cisplatin에 의한 형태학적인 변화는 대개 외유모세포의 변성이며,¹⁾⁵⁾⁶⁾⁷⁾ 그밖에 코티기관의 지지세포 또는 Reissner막의 이상소견 등을 관찰할 수 있다고 하였다.⁶⁾⁸⁾
세포질내의 유리 Ca²⁺ 이온의 양은 기본적인 세포의 기능을 수행하는데 매우 중요한 역할을 하고 있다. 세포내 Ca²⁺ 이온의 증가는 대개 세포막의 Ca²⁺ 이온통로를 통한 Ca²⁺의 유입이나 세포내 Ca²⁺ 저장장소에서 유리되는 Ca²⁺ 등에 의해서 생기는데, 와우의 유모세포에서는 전압의존성 Ca²⁺ 이온통로를 통한 Ca²⁺의 유입이 Ca²⁺ 의존성 K⁺ 전류를 조절하고,⁹⁾¹⁰⁾ 신경전달 물질의 분비와¹¹⁾ 외유모세포의 길이를 조절하는것¹²⁾으로 알려져 있다.
McAlpine 등은¹³⁾ 유색기니픽를 이용한 cisplatin 이독성 실험을 통하여 cisplatin이 외유모세포의 신호전달 통로를 차단하여 난청을 유발한다고 하였는데, 유모세포의 신호전달에는 Ca²⁺이 중요한 것으로 알려져 있으므로¹⁴⁾¹⁵⁾¹⁶⁾ 이와 같은 관찰은 cisplatin에 의해 외유모세포에 대한 직접적인 손상의 가능성을 더욱 높여주는 것이라고 할 수 있다. Laurell 등은¹⁷⁾ cisplatin 투여 후 내림프의 K⁺ 이온의 수동적인 이동이 변화된다고 하였고, Saito 등은¹⁸⁾ 외유모세포의 미토콘드리아 DNA 등의 표적분자와의 상호작용에 의해 이독성이 나타날 것으로 주장하였다. 그러므로, 외유모세포에서 cisplatin에 의한 신호전달 체계의 변화에 관한 연구를 통해 cisplatin 이독성의 기전을 밝혀야 할 것이다.
본 연구에서는 기니픽에서 분리된 외유모세포에서 Fura-2 형광염색물질을 이용하여 cisplatin 투여 후 세포내의 Ca²⁺ 이온의 양의 변화를 관찰하고 이를 통하여 cisplatin이 Ca²⁺의 조절기전에 미치는 영향을 평가하고자 한다.
이러한 연구를 통하여 청각생리 중 유모세포의 신호전달체계의 어떤 부분이 cisplatin에 의해 손상받고 있는지를 밝힐 수 있고, 더 나아가서 이런 손상을 미리 예방할 수 있는 연구가 가능하게 될 것이다.

연구재료 및 방법

연구재료

흰색 기니픽(200~250 g)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 양측의 측두골을 얻었다. Modified Leibovitz 용액 내에서 중이강을 열고 와우를 노출시킨 후 와우골포를 제거한 후 코티기관를 꺼내어 dispase(Godo Shusei, Japan, 400 protease unit)로 5분간 처리한 후 pasteur 피펫으로 흡인, 배출하여 외유모세포를 분리하였다. 분리된 외유모세포를 modified Leibovits 용액이 포함된 35 mm 배양용기에 넣어 95% O₂, 5% CO₂ 배양기에서 20~30분간 배양하여 세포가 바닥에 붙도록 하였다. 분리된 세포 중 세포의 모양이 실린더 모양이고, 핵이 세포의 기저부에 위치하며, 세포의 첨부표면에 유모가 있는 것을 관찰하여 외유모세포임을 확인하였다. 실험은 실온의 도립현미경 시야에서 실시하였고, 용액은 주기적으로 관류하여 세포분리의 부유물이 없도록 하였다.

Ca²⁺ imaging을 이용한 세포내 Ca²⁺ 농도의 측정

35 mm 배양용기 밑에 구멍을 뚫고 유리 슬라이드를 붙인 후, 유리부분을 poly-L-lysine으로 덧입히고 분리된 외유모세포를 부착시켰다. Fura-2 AM(Molecular Probes, USA) 형광염색액 2 mM를 첨가하고 20분이 지난 후 정상 Tyrode 용액으로 배양용기를 채우고 Attofluor(Atto, USA)를 이용하여 340 nm, 380 nm의 빛을 번갈아 주면서 세포로부터 방사되는 510 nm의 빛을 측정하였고, 이들의 비율을 구하여(R=F340/F380 nm) 세포내의 Ca²⁺의 양을 상대적으로 측정하였다. 100 mM K⁺용액(high K+ 용액, HK)을 이용하여 세포막의 탈분극을 유도하였고, nifedipine 3 μM(Nifedipine-HK)과 cisplatin 0.3 mM(CP-HK)을 추가 관류하여 이 때 생기는 세포내의 Ca²⁺ 양의 변화를 관찰하였다. 세포내 유리 칼슘농도는 다음의 식을 이용하여 측정하였다.

[Ca²⁺]i=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)F380 max/min

Kd 값은 calcium calibration kit(Molecular Probes Inc., USA)를 이용하여 calibration하여 구하였다. 본 실험에서 측정된 Fura-2의 외유모세포내에서의 Kd 값은 243 nM이었다.

사용한 용액

본 실험에 사용한 용액은 다음과 같다. Modified Leibovits 용액은 NaCl 142.2 mM, KCl 5.37 mM, CaCl₂ 1.25 mM, MgCl₂ 1.48 mM, HEPES 5.0 mM, dextrose 5.0 mM로 조성하였고, pH는 NaOH로 적정하여 7.4로 맞추었고, dextrose를 이용하여 300 mOsm로 맞추었다. 정상 Tyrode 용액은 NaCl 143 mM, KCl 5.4 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 2 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM로 조성하였고, NaOH를 이용하여 pH를 7.4로, dextrose를 이용하여 300 mOsm로 맞추었다. HK 용액은 NaCl 55.6 mM, KCl 100 mM, CaCl₂ 2.2 mM, MgCl₂ 1.2 mM, glucose 10 mM, HEPES 5 mM로 조성하였다.

연구결과

고농도의 칼륨이온의 자극에 의한 세포내 칼슘의 변화에 미치는 cisplatin의 영향

정상 Tyrode 용액상태에서 고농도의 칼륨이온(100 mM K⁺, HK) 용액을 관류시켰을 때 세포내의 상대적인 Ca²⁺ 농도의 증가를 보였다. Cisplatin과 고농도의 칼륨이온(CP-HK) 용액으로 관류하였을 때 세포내 Ca²⁺ 농도가 증가하였으나 HK용액 관류 시보다 약 15% 감소된 양상을 보였고, 다시 정상 Tyrode 용액으로 씻어내도 Ca²⁺ 농도가 자극전의 농도로 돌아오지 않았다(Fig. 1). CP-HK 용액으로 관류시킨 후 정상 Tyrode 용액, HK 용액의 순으로 관류시켰을 때 세포내 Ca²⁺ 농도는 점점 증가하는 양상을 보였고 basal level도 상승하였다(Fig. 2). Nifedipine-HK 용액으로 관류하였을 때 세포내 Ca²⁺ 양은 점점 감소하였으나 basal level까지 감소하지 않고, 최대치의 약 34% 정도 감소된 상태에서 고평부를 이루었고, 다시 CP-HK 용액으로 관류하였을 때 처음 관류시보다 세포내 Ca²⁺ 농도가 급격히 증가하며 결국 세포가 죽는 소견을 보였다(Fig. 3).

정상상태에서 cisplatin에 의한 세포내 칼슘농도의 변화

세포외액에 칼슘이온이 없는 경우에는 cisplatin을 투여하여도 세포내 칼슘농도의 변화가 관찰되지 않았다. 그러나 세포외액에 칼슘이온을 넣은 후에는 cisplatin에 의하여 세포내 칼슘농도가 증가하였다(Fig. 4). 또한 칼슘통로 차단제인 verapamil을 같이 투여하였을 때는 cisplatin에 의해서 세포내 칼슘농도의 변화가 없었으나 cisplatin만을 투여하였을 때는 세포내 칼슘농도가 증가되었다(Fig. 5) 이를 통하여 cisplatin에 의해 증가하는 세포내 칼슘은 세포외액에서 세포막을 통해 유입된 것임을 알 수 있었다.

고 찰

본 연구를 통하여 cisplatin이 세포내 칼슘농도를 증가시키는 것이 확인되었다. 또한 세포막의 칼슘이온 통로를 통하여 세포외액의 칼슘이온이 유입되기 때문에 발생하는 것도 확인되었다.
Saito 등은¹⁸⁾ 외유모세포를 분리하여서 실험적으로 indo-I의 방사형광치를 측정하는 방법으로 cisplatin의 영향을 관찰하였는데, cisplatin에 의하여 Ca²⁺ 이온통로가 완전히 차단된다고 하였다. 그러나 본 연구에서 Fura-2 형광염색액을 이용한 세포내 Ca²⁺ 농도의 측정 결과 cisplatin이 HK에 의한 전압의존성 Ca²⁺ 이온통로를 어느 정도(약 15%) 차단하였지만 완전히 차단치는 못하였다. 이러한 차이는 세포의 길이에 따른 차이로 생각할 수도 있고, 또 본 연구에서는 실온에서 실험을 하였기 때문에 37℃에서 활성화되는 세포내의 여러가지 활성인자들이 비활성화된 상태로 남아있기 때문으로 생각할 수도 있다. 이는 37℃ 상태의 실험조건에서 실험함으로 알 수 있을 것이다. 정상 Tyrode 용액으로 관류하였을 때 세포내 Ca²⁺ 농도가 관류전의 basal level로 떨어지지 않고 계속 상승하였는데, 이는 cisplatin에 의하여 Ca²⁺의 유입이 차단되지만 그후에는 다시 세포내의 Ca²⁺ 양이 증가하는 것을 뜻한다. 세포내에는 소포체 등에 Ca²⁺ 저장장소가 존재하고 여기서 분비되는 Ca²⁺ 이온도 세포내 Ca²⁺ 농도를 조절하므로 이러한 조절능력이 상실된 것으로 추측할 수 있다. 또한 L-형 Ca²⁺ 이온통로 차단제인 nifedipine을 투여한 후에도 세포내의 Ca²⁺ 농도가 34% 밖에 감소하지 않은 것과 cisplatin을 다시 투여하였을 때 Ca²⁺ 농도가 다시 증가하는 것을 보면 세포내 Ca²⁺ 저장장소 뿐 아니라 Ca²⁺ 이온통로 이외의 비특이성 양이온통로가 열려서 Ca²⁺이 세포내로 유입될 가능성도 생각할 수 있다.
정상상태에서 cisplatin을 투여하였을 때 세포내 칼슘농도가 증가하였다. 세포내 칼슘이온의 증가는 생리적으로 중요한 여러가지 기전을 활성화시켜서 기능을 유지하는데 도움을 주기도 하지만 과다하게 증가되면 칼슘이온에 의한 세포독성이 생겨서 세포의 과사가 발생하게 된다. 과다한 세포내 칼슘이온으로 인한 apoptosis는 이미 잘 알려져 있는 현상이다.¹⁹⁾²⁰⁾ 그러므로 cisplatin은 세포내 Ca²⁺ 이온의 양을 조절하는 여러가지 기전에도 관여하여 이들을 차단, 손상시키고 이를 통해 세포내의 난청의 유발 및 세포의 괴사를 초래할 가능성이 있다.

결 론

Cisplatin은 외유모세포의 신호전달 체계에 중요한 요소인 Ca²⁺ 이온통로를 방해하여 세포의 기능을 떨어뜨림으로 난청을 유발하고, 세포내 Ca²⁺의 농도조절 기전을 손상시켜서 세포내의 Ca²⁺ 농도를 증가시키고, 이를 통해 세포의 기능소실, 세포의 괴사를 초래할 것으로 생각된다.

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