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Anatomy and physiology
Korean Journal of Audiology 2007;11(1):3-8.
Expression & Role of Neural Cell Adhesion Molecule and Polysialic Acid in Differentiation of Adult Neural Stem Cell Derived from Guinea Pig Spiral Ganglion
Kyoung Ho Park, Ji-Hyeon Shin, Chang-Hyun Yun, Jong-Hoon Kim, Nam-Sik Kim, Sang Jae Cho, Shi-Nae Park, Sang W. Yeo
Department of Otolaryngology-HNS, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea
기니아피그 와우신경절 성체신경줄기세포에서의 신경접착분자와 Polysialic Acid의 발현과 줄기세포 분화에 대한 영향
박경호, 신지현, 윤창현, 김종훈, 김남식, 조상재, 박시내, 여상원
가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
Abstract

Background and ObjectivesIn 2005, Helge Rask-Andersen and Park isolated and cultured adult neural stem cells specific to inner ear from Ginea pigs and human spiral ganglion successfully. The purpose of this study is to identify the expression of neural cell adhesion molecule from neural stem cells and to assess the influence of its glycosilation and deglycosilation to neural stem cell differentiation.

Materials and Methods:Spiral ganglions were isolated from anesthetized Ginea pigs. The cells were triturated by trypsinization and addition of DNase and cultured in the media including epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF). The cultured cells were stained with stem cell markers such as bromodeoxyuridine (BrdU) and nestin. These cells were stained with neural cell adhesion molecule (NCAM) and polysialic acid (polySia) to identify their expression. And endoneuraminidase (endo-N), the enzymes that remove polySia from NCAM, was added to the culture media for 24 hours and we checked the degree of the differentiation.

Results:The neural stem cells from spiral ganglion expressed NCAM and polySia. In the group with Endo-N, the differentiation of neural stem cells to neuron and glial cells were decreased.

Conclusion:Spiral ganglion neural stem cells express NCAM and polySia. The glycosilation of NCAM may have a important role in neural stem cell differentiation as a positive regulator. 

Keywords: Neural stem cell;Neural cell adhesion molecule;Polysialic acid;Differentiation.

교신저자:여상원, 137-040 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자:전화:+82-2-590-1349, 전송:+82-2-595-1354, E-mail:swyeo@catholic.ac.kr

서     론


신경접착분자(neural cell adhesion molecule, NCAM)은 신경원, 신경절, 그리고 골격근의 표면에 위치하는 친동종 결합 당단백(homophilic binding glycoprotein) 이다. 이 당단백은 세포간의 접합과 신경세포의 이동과 분화, 신경돌기의 성장, 시냅스의 유연성 및 학습과 기억에 관련된 기능을 한다고 알려져 있다. Polysialic acid(polySia)는 α2,8-linked N acetylneuraminic acid(NeuNAc)의 선상 단일 중합체(linear homopolymer) 로서 NCAM에 부착되어 그 기능을 조절한다. PSA의 표면 발현은 발생학적으로 중추 신경계와 말초 신경계에서 조절 받는 것으로 알려져 있다.1,2,3,4,5)
중추 신경계 신경줄기세포에서의 polysialyated NCAM (embryonic form NCAM)은 줄기세포의 이동 및 중추 신경계의 치유를 증진시키며 뇌실인접 구역(subventricular zone)에서의 미성숙한 세포 분화를 지연시키는 것으로 알려져 있다. 그리고 또한 후각 사이신경원(interneuron) 전구체(precursor)를 이동시켜 연쇄 형성을 촉진하며 NCAM(+) neurosphere는 가소성(plasticity)이 높은 것으로 알려져 있다. 중추 신경계에서 축삭에 존재하는 polySia는 수초화를 억제하는 조절자로 역할을 하며, polySia가 가지는 음전하로 인하여 신경절 형성과 관련한 NCAM의 접착 기능을 방해하여 negative regulator로 작용하는 것으로 생각된다.1,2)
2005년에 Helge, 그리고 2006년 Park 등은 포유류의 와우 신경절에서 sphere forming cell을 분리 및 분화를 유도하는 데에 성공하였다.2) 본 연구에서는 성체 기니아 피그 와우신경절에서의 성체 신경줄기세포를 분리, 배양하고 이 세포에서의 NCAM과 polySia의 발현을 확인하며, 신경줄기세포의 분화와 관련한 NCAM glycosilation의 역할을 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

기니아 피그 와우신경절의 분리와 배양
실험 동물로 300 g 기니아 피그의 복강에 Pentobarbital을 주입하여 마취한 뒤 경부절제를 시행하여 와우신경절을 분리하였다. 이후 세포분리과정을 진행하기 위하여 얻어진 조직을 Ducobecco’s modified Eagle's media(DMEM, Gibco, Carlsbard, CA, USA)가 들어있는 용기에 옮긴 후 3차례 DMEM으로 세척을 시행하였다. 그 후 0.25% trypsin(Gibco)이 들어있는 15 ml tube로 옮긴 후 37℃하에서 20분 간 배양하였다. 그 다음 DNase Ⅰ(Invitrogen, Carlsbard, CA, USA) 10 mg/ml를 첨가하고 세포들을 조심스럽게 파쇄하며, 비교적 큰 세포 혹은 조직들은 아래로 가라앉을 수 있도록 2분 정도 실온에 방치하였다. 상층액은 새로운 tube로 옮긴 후 10% fetal calf serum(Gibco)으로 효소작용을 멈추게 하고, 이들은 다시 1000 rpm으로 5분 간 원심분리를 시행하였다. 침전물은 신경구의 배양을 위하여 B27 supplement(Invitrogen), L-Glutamin(Sigma, St. Luise, MI, USA)과 Gentamycin(Gibco)이 포함한 F12와 DMEM이 1:1로 함유된 배양액에 부유시켰다. 배양 초기의 배양 배지에는 epidermal growth factor(EGF, Invitrogen)와 fibroblast growth factor(FGF, Invitrogen)을 첨가하였다. 매 3일 마다 성장인자가 첨가된 새로운 배양액 반 정도를 기존 배양액에 넣어주고 9일째 되는 날 배지를 갈아주었다. 
그리고 신경구로부터 분화되는 세포의 확인을 위해 신경구의 일부를 B27 supplement(Invitrogen), L-glutamin과 gentamycin이 포함된 neurobasal medium(Gibco)으로 옮겨서 분화를 유도하였다. 이들 배양액에는 glial cell derived neurotrophic factor(GDNF, Invitrogen), brain derived neurotrophic factor(BDNF, Invitrogen)와 neurotrophin-3(NT-3, Invitrogen)을 첨가하였으며 이들 세포들을 코팅된 배양 접시에 분양하였다. 
증식하는 세포를 알아보기 위해 배양된 세포는 cover slide가 깔린 6-well에 옮긴 후 10 μM bromodeoxyuridine(BrdU, ABD serotec, Raleigh, NC, USA)를 신경구와 분화된 세포에 첨가하였다. BrdU는 4
~12시간 동안 처리하였다.
분화된 세포는 통상적인 조직학적 고정 방법에 따라 15분 간 4% paraformaldehyde(Sigma)에 고정한 후 PBS로 washing을 해 주었다. 5분간 0.2% triton-X100 PBS(Junsei chemical. Tokyo, Japan)로 incubation 한 후 BrdU 염색을 위해 1시간 동안 2M HCl로 배양하여 DNA denaturation을 하였다. 그 후 neutralization 과정을 위해 0.1 M의 Na2B4O7(Sigma)을 이용하여 5분간 배양을 한 후 PBS를 이용하여 세척해 주었다. 그리고 10% goat serum(Vector Lab. Inc. Peterborough, England)을 이용하여 blocking을 시행하였다.
BrdU와 함께 이중형광염색(double staining)을 위해 각각 nestin(Chemicon, 1:200), polysialylated NCAM (Sigma, 1:100), non-polysialylated NCAM(ZYmed, 1:100), βⅢ tubulin(Chemicon, 1:100), S-100(Sigma, 1:100)에 대한 특이 항체를 10% goat serum이 포함된 PBS에 1차 항체를 희석하여 넣은 후 4℃에서 12시간 배양하였다. 이후 PBS를 이용하여 세척을 한 후에 2차 항체로서 cyanine-conjugated secondary antibody인 goat anti-Rat IgG Antibody(Alexa Fluor-red colour for BrdU, ABCam, Cambridge, England)와 sheep anti-mouse Cy2(Cy2-green colour for nestin, NCAMs and βⅢ tubulin, Jackson, Baltimore, PA, USA), Goat anti-rabbit Fluorescein Isothiocyanate(FITC, green colour for S-100, ABCam)를 10% goat serum이 포함된 PBS로 1:200으로 희석하여 넣어 붙여주었다. PBS로 세척을 한 후 mounting medium for fluorescence(Vector Lab. Inc.)를 이용하여 mounting 하였다. 그리고 핵 염색을 위해서 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Vector Lab. Inc.)을 사용하였다.

Endo-N 처치와 분화 비교
   Neurosphere 배지에서 3번의 계대 배양 후 neurosphre를 분화 배지로 분양을 한 후 polySia 제거효소인 endoneuraminidase(Endo-N)을 0.5 U 투여하여 24시간 배양하였다. 이후 3, 7일째 분화 배지에서 분화된 세포들을 Endo-N을 투여하지 않은 대조군과 비교하였다. 100 배율의 현미경하에서 신경줄기세포 주위의 분화된 세포수를 비교하였다. 

결     과 

EGF와 FGF를 포함한 신경줄기세포 배양을 위한 배지에서의 3 passage 배양 후 관찰 결과 구 형태를 지니는 세포의 군집들을 확인할 수 있었고, 이들은 줄기세포의 표지자 및 증식하는 세포들의 표지자로 알려진 BrdU와 신경줄기세포의 표지자로 알려진 nestin을 모두 발현하였다(Fig. 1). 이들 neurosphere는 계대 배양과 self-renewal이 가능하였다. 
그리고 특정 세포로의 분화를 확인하기 위한 위의 일부 neurosphere를 BDNF, GDNF, 그리고 NT-3가 포함된 분화 배지(differentiation media)에서의 배양을 통해서 이들을 특정한 신경세포들로 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포들에 대하여 각각의 신경 표지자를 통해서 확인을 하였다. 분화된 세포들은 βⅢ tubulin에 양성반응을 보이는 신경원세포와 S-100에 양성반응을 보이는 신경교세포로 분화됨을 확인할 수 있었다. 그리고 이들 분화된 신경세포들을 BrdU도 발현함을 확인하여 이들이 증식하는 신경구로부터 분화된 세포임을 확인할 수 있어 줄기세포에서 보여주는 다양한 세포들로 분화될 수 있는 다능성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 
이러한 신경줄기세포에 대해 polysialyalted NCAM (polySia-NCAM)과 non-polysialylated NCAM에 대해 면역형광염색을 시행하여 이들 모두가 발현함을 확인할 수 있었다(Figs. 2 and 3).
이들 줄기세포에 대해 분화배지에서 Endo-N을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 비교하였을 때, Endo-N을 처리한 군에서 신경구로부터 신경세포들로의 분화가 덜 일어남을 확인할 수 있었다. 3일째와 7일째에 Endo-N을 처리한 군에서 신경구 주위에서 분화된 세포들은 100배하에서 관찰한 결과 각각 2
~3개와 5~6개 정도의 분화된 세포가 관찰되었고 대조군에서는 10개 내외와 30개 정도의 분화된 세포들이 관찰되어 그 차이가 더욱 확연한 것을 볼 수 있었다(Fig. 4

고     찰 

신경줄기세포의 표지자라고도 알려진 신경접착분자는 세포접착분자의 일종으로 세포 표면의 고분자 당단백질로서 세포의 접착과 이동에 관여한다. 또한 여기에 부착되는 polySia는 음전하를 띄는 분자 구조로 인해 신경접착분자의 기능을 조절하게 된다. 이러한 polySia는 oncodevelopmental antigen으로 알려져 있으며 일부 종양에서 원격전이를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 신경접착분자에 부착되어 있는 polySia의 정도에 따라 embryonic form NCAM 혹은 polysialylated NCAM(polySia-NCAM)과 adult form NCAM 혹은 non-polysialylated NCAM(NCAM)으로 나눌 수 있다. polySia-NCAM의 경우 55개 이상의 sialic acid를 포함하게 되며 출생 후 성장과정에서 지속적으로 sialic acid 수가 감소하여 NCAM 에서는 적은 수의 sialic acid를 포함하게 된다. 이러한 polySia moiety의 감소는 발생학적으로 조절되어 감소되며 정상적인 발달과정에 매우 중요하며 신경계의 발달과 성장에 중요한 요소로 알려져 있다.3,4,5)
Stoenica 등은 mice의 dentate gyrus에서 NCAM 과 polySia가 시냅스의 가소성에 필요하다 주장하였으며, Seidenfaden 등은 in vitro 실험을 통해 NCAM이 신경돌기 형성을 조절하는 것으로 보고하였다. 또한 실험을 통해 polySia가 NCAM의 세포접착을 조절한다는 것을 Johnson 등이 주장하였으며, Suzuki 등은 polySia가 뇌 신경교종 환자에서 신경세포의 이동과 재생에 관여하여 종양의 침습을 촉진시킨다고 주장하였다.6,7,8,9) 
이와 같이 NCAM과 polySia는 배아 및 성체 신경계에서 축삭 성장, fasciculation, 세포 이동, 시냅스 가소성, 활동 유발성 가소성, 신경 및 신경교의 가소성, 그리고 배아 및 성체 신경형성 등에 관여한다.1,10,11,12,13) 
특히 polySia가 NCAM에 작용하여 신경조직의 형성 시 세포접착을 조절하여 세포의 이동, 시냅스의 형성 및 신경계의 기능적 가소성에 미치는 영향을 여러 보고자들이 확인한 바 있다.14,15,16)
이러한 NCAM과 polySia는 신경줄기세포의 증식과 분화에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 중추 신경계 신경줄기세포에서의 polysialyated NCAM(embryonic form NCAM)은 줄기세포의 이동 및 중추 신경계의 치유를 증진시키며 뇌실인접 구역(subventricular zone)에서의 미성숙한 세포 분화를 지연시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 신경접착분자에서 polySia moeity를 제거할 수 있는 endoneuriminidase(Endo-N)을 이용하여 신경접착분자의 glycosilation이 신경줄기세포의 분화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 
Endo-N은 bacteriophage K1F에서 생성되는 효소로서, 특이적으로 NCAM으로부터 polySia를 제거 할 수 있다.3) 따라서 Endo-N의 작용으로 NCAM의 기능이 달라지게 되어 접착 기능이 감소하고 세포의 이동성이 증가하게 된다. 이를 이용하여 본 연구에서는 먼저 성체 신경줄기세포에서 NCAM과 polySia가 발현되는 것을 확인 한 뒤, Endo-N을 처리하여 Endo-N을 처리하지 않은 대조군과 그 분화정도를 비교하였다. 그 결과 대조군에 비해 Endo-N 처리한 군에서 성체신경줄기세포로부터 신경원세포와 신경교세포의 분화가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이는 신경줄기세포에서의 분화에 있어 polySia에 의해 정상적인 분화 과정이 이루어지거나 촉진된다고 생각되어지며, polySia의 제거로 NCAM간의 접착성 내지는 이들 간의 특성으로 인해 분화가 억제되어지는 것으로 생각된다. 
결론적으로 본 연구를 통하여 polySia-NCAM이 와우신경절에서 성체신경줄기세포의 신경원세포와 신경교세포로의 분화에 positive regulator로서 영향을 미칠 것으로 생각되어진다. 

결     론 

기니아 피그 와우신경절 성체신경줄기세포는 NCAM과 polySia를 발현하며, NCAM의 glycosilation(polySia-NCAM)은 신경줄기세포의 분화에 있어 positive regulator로서 분화에 있어 중요한 역할을 하리라 생각된다. 


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