Effect of Prednisolone on Acoustic Trauma Applied in the Inactive Phase of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Mice

Kim, Jong Yang; Ahn, Joong Ho; Chung, Jong Woo

Original Article

Auditory and vestibular disorders

Korean Journal of Audiology 2009;13(2):156-159.

Effect of Prednisolone on Acoustic Trauma Applied in the Inactive Phase of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Mice

Jong Yang Kim¹, Joong Ho Ahn², Jong Woo Chung²

¹Department of Otolaryngology, Gangneung Asan Hospital, College of Medicine, University of Ulsan, Gangneung
²Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, College of Medicine, University of Ulsan, Seoul, Korea

마우스에서 시상하부-뇌하수체-부신축의 비활성기에 투여한 프레드니졸론의 소음성 난청에 미치는 영향

김종양^¹^, 안중호^²^, 정종우^²

^¹울산대학교 의과대학 강릉아산병원 이비인후과학교실
^²서울아산병원 이비인후과학교실

Abstract

Background and Objectives
Corticosterone concentrations of the BALB/c mice hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis exhibit circadian variation. The present study aimed to evaluate the effect of the exogenous prednisolone supply in the inactive phase of HPA axis activity in BALB/c mice.

Materials and Methods
Hearing was measured before noise exposure, and from 1 hour to 10 days after noise exposure (at 8：00-11：00 a.m.) in the prednisolone (2 mg/ kg) supplied group and controls at 7：30.

Results
The control group showed elevated threshold shifts at after noise exposure relative to the group supplied with 2 mg/kg prednisolone (p<0.05).

Conclusions
Exogenous prednisolone supply before noise exposure in the inactive phase of HPA axis activity may have a protective effect on hearing against noise exposure to make temporary threshold shift.

Keywords: BALB/c mouse;Hypothalamic-pituitary-adrenal axis;Corticosterone;Noise;Hearing.

Address for correspondence : Jong Woo Chung, MD, Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, College of Medicine, University of Ulsan, 338-1 Pungnap 2-dong, Songpa-gu, Seoul 138-736, Korea
Tel : +82-2-3010-3718, Fax : +82-2-489-2773, E-mail : jwchung@amc.seoul.kr

서 론

일반적으로 돌발성 난청에 사용되는 스테로이드를 소음성 난청의 예방 또는 치료 방법으로 사용할 수도 있다. 실제로 기니픽에 프레드니졸론이나 메칠프레드니졸론을 장간막, 근육 또는 정맥을 통해 투여하면 소음에 의한 난청을 감소시키는 것으로 알려져 있다.^1,^2,³⁾ 또한 덱사메타존을 직접 내이내로 투여하였을 때 소음에 의한 외유모세포의 소실을 막을 수도 있다.⁴⁾ 이러한 결과들을 볼 때 혈중 코티코스테론의 농도가 소음성 난청의 심한 정도와 연관되어 있음을 추측할 수 있다.
이렇게 외부에서 투여한 당질코르티코이드가 소음성 난청에 대한 예방효과가 있지만 하루 중 언제 투여하느냐에 따라 효과가 달라질 수 있다. BALB/c 마우스에서 혈중 코티코스테론의 농도는 오후 4시에 가장 높고 이후 밤 10시까지 감소한다.⁵⁾ 즉, 시상하부-뇌하수체-부신 축(hypothalamic-pituitary-adrenal: HPA axis)이 가지고 있는 circadian 리듬때문에 light phase가 시작될 때는 코티코스테론의 농도가 낮고(비활성기, inactive phase), dark phase가 시작될 때 농도가 높아진다(활성기, active phase).⁵⁾ 그러므로 HPA 축의 비활성기에 소음에 노출되면 활성기에 소음에 노출되는 것보다 더 청력의 소실이 더 커진다.⁶⁾ 그러므로 코티코스테론 농도가 적은 비활성기에 당질 코티코이드를 투여하면 더 큰 청력의 손실을 예방할 수 있을 것으로 생각할 수 있다. 본 연구에서는 소음에 노출된 마우스에 프레드니졸론을 HPA 축의 비활성기에 구강 섭취시켜서 청력의 변화를 관찰하며 이를 통해 외부에서 투여한 프레드니졸론의 효과기전을 파악하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 동물
Preyer 반사가 정상이고 청력이 정상인 4주령 수컷 마우스(BALB/c; Orient Bio, Inc., Seongnam, Korea)를 사용하였다. 마우스는 12시간 간격의 명암기가 잘 조절되는 동물실에서 케이지에 넣어서 사육하였다. 사료와 수분은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물 실험은 미국 국립보건원의 규정과 헬싱키 선언에 맞추어 진행되었고 동물 실험 계획서는 울산대학교 동물실험위원회의 승인을 받았으며 아산생명과학연구소 동물 실험실의 감독하에 진행되었다.

실험 방법
마우스에 프레드니졸론을 오전 8시에 구강으로 투여하였고 그 후 시간 간격으로 혈중 코티코스테론 농도를 측정하였다. 투여한 코티코스테론의 농도는 각각 2 mg/kg와 1 mg/kg로 마우스를 코티코스테론 투여군(1 mg/kg군, 2 mg/kg군)과 대조군으로 나누었다. 36마리의 마우스를 12마리씩 3개의 군으로 나누고 각 군을 3마리씩 나누어 투여 후 혈액채취 시간은 투여 직후인 8시, 8시 30분, 9시, 11시로 각 군당 4회이었다.
청력역치는 청성뇌간반응(auditory brainstem response: ABR)을 측정하여 결정하였다. 청력역치는 프레드니졸론 2 mg/kg군과 대조군에서 측정하였다. 각 군은 8마리씩으로, 각 군당 약제의 투여 직전인 오전 7시에 전 청력역치를 측정하였고 오전 7시 30분에 약제의 투여, 오전 8시부터 11시까지 소음을 주고 소음 노출 후 1, 3, 5, 22, 24시간째에 측정하였다. 또한 1, 3, 5, 7, 10일째에 청력을 측정하였다. 이 경우에는 모두 오전 7시에 측정하였다.

소음발생
개인용 컴퓨터와 연결된 증폭기(R-399; Interm, Seoul, Korea)로 백색잡음(300~10,000 Hz)을 만들어 스피커(290 -8L; Altec Lansing, Oklahoma City, OK, USA)를 통해 120 dB peSPL의 강도로 마우스에게 3시간 동안 자극하였다.

청성뇌간반응검사
마우스를 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine(2 mg/kg)을 투여하여 마취시킨 후 Auditory Evoked Potential Workstation(Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA)과 외이도에 꽉 맞도록 고안된 프로브를 이용하여 각 귀의 청력을 측정하였다. 측정을 위한 자극음은 클릭음을 이용하였고 클릭음에 대한 반응을 측정하였다. 각군의 청력역치는 평균±표준편차로 표시하였다.

혈중 코티코스테론의 농도 측정방법
마우스의 복부에 있는 abdominal inferior vena cava로부터 0.5 mL의 혈액을 얻었다. 혈액은 상온에서 300×g로 15분간 원심분리한 후 혈청을 얻어 -20℃에 냉동보관하였다. 혈중 코티코스테론 농도는 ELISA kits(Assay Designs Correlate-EIA; Assay Designs, Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. 이 기기의 민감도는 27.0 pg/mL이다.

통계처리
모든 자료는 평균±표준편차의 형태로 표시하였다. 통계분석을 위한 프로그램은 SPSS 12.0 K(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다. 각 군내에서 소음 노출 전 후의 청력역치의 차이는 Wilconxon signed rank test를 이용하여 검증하였다. 각 군간의 청력역치의 차이는 repeated measures ANOVA를 이용하여 검증하였다. 유의수준을 95%로 정하여 p값이 0.05 이하인 경우 통계적인 의미가 있는 것으로 판단하였다.

결 과

프레드니졸론 투여에 따른 혈중 코티코스테론의 변화
프레드니졸론 2 mg/kg를 구강섭취시킨 군(n=3)의 코티코스테론 농도는 오전 8시에 138.8±13.4 ng/mL, 8시 30분에 331.1±73.8 ng/mL, 9시에 324.7±63.7 ng/mL, 11시에 372.5±60.9 ng/mL이었다. 프레드니졸론 1 mg/kg를 구강섭취시킨 군(n=3)에서 코티코스테론의 농도는 각각 189.7±16.2 ng/mL, 231.5±18.8 ng/mL, 252.4±24.2 ng/mL, 289.9±13.6 ng/mL이었다. 대조군에서는 각각 134.7±78.4 ng/mL, 131.6±19.5 ng/mL, 130.5±26.7 ng/mL, 154.3±20.4 ng/mL이었다. 프레드니졸론을 투여한 두 군에서 혈중 코티코스테론 농도는 투여하기 전보다 통계적으로 유의한 증가를 보였으며(repeated measures ANOVA, p<0.05), 투여 후 30분부터 통계적으로 유의하게 증가하여 투여 후 3시간까지 지속적으로 증가하였다(Fig. 1).

소음성 난청에 미치는 프레드니졸론의 효과
소음 노출 전의 모든 마우스의 청력은 20~25 dB HL 이었다. 프레드니졸론 2 mg/kg를 투여받은 마우스에 소음을 자극하였을 때 청력은 1시간 후 48±5.3 dB, 3시간 후 48±2.6 dB, 5시간 후 43±7.5 dB, 22시간 후 34±4.2 dB, 1일 후 31±5.6 dB, 3일 후 25±3.8 dB, 5일 후 23±2.7 dB, 7일 후 20±3.8 dB, 10일 후 20±2.7 dB이었다. 대조군의 경우 소음 자극 후 청력은 1시간 후 51±7.3 dB, 3시간 후 53±5.3 dB, 5시간 후 49±5.2 dB, 22시간 후 39±7.4 dB, 1일 후 36±6.8 dB, 3일 후 30±3.8 dB, 5일 후 24±2.3 dB, 7일 후 21±3.5 dB, 10일 후 23±2.7 dB이었다. 프레드니졸론을 투여한 군에서는 소음 노출 후 3일째에 소음 노출 전의 청력으로 회복되었으며 대조군에서는 소음 노출 후 5일째에 소음 노출 전의 청력으로 회복되었다(Wilcoxon signed rank test, p<0.05). 또한 대조군은 프레드니졸론을 투여한 군보다 더 큰 청력역치 변화를 보였다(repeated measures ANOVA, p<0.05)(Fig. 2).

고 찰

본 연구를 통해 HPA축의 비활성기에 혈중 코티코스테론의 농도가 적었고 이는 소음에 의한 청력악화에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이러한 코티코스테론 농도의 변화는 청각기관의 소음에 대한 감수성에 영향을 미치는 것으로 보인다. 당질코티코이드 수용체는 와우 및 전정기관에서 발견되었고,^7,^8,^9,^10,¹¹⁾ 이는 내이에서도 당질코티코이드가 단백질과 탄수화물 대사, 신경활성, 이온항상성의 유지, 그리고 면역기능과 염증반응의 억제 등을 일으킬 수 있음을 의미한다.¹²⁾
당질코티코이드와 그 수용체 결합복합체는 핵안으로 들어가서 특정한 DNA 시퀀스와 결합하고 유전자 전사를 일으켜서 특정 mRNA와 해당 단백질의 발현을 조절한다. 그러므로 당질코티코이드는 대사작용효소와 면역억제단백질을 증가시킨다.¹³⁾
당질코티코이드는 속박 스트레스(restrain stress), 열쇼크(heat shock), sound conditioning에 의하여 증가하며 이것은 이어지는 소음 자극에 대해 내이보호효과를 가진다.^14,^15,^16,¹⁷⁾ 이러한 현상은 코티코스테론 생성억제제인 metyrapone, 또는 당질코티코스테론 수용체 억제제를 투여하였을 때 억제된다. 그러므로 혈중 코티코스테론 농도는 소음성 난청에 대한 내이의 감수성을 조절하는 기전으로 생각할 수 있을 것이다.
본 연구에서는 조직소견을 관찰하지 않았다. 그러나 일과성 소음성 난청 모델의 경우 속박스트레스를 주고 난 후 소음을 노출시킨 연구 결과,¹⁸⁾ ABR 역치가 모두 정상으로 회복되고 내이와 신경절세포의 손상이 보이지 않았기 때문에 본 연구의 경우도 조직소견의 이상을 기대하기는 어려웠을 것으로 생각한다.
메틸프레드니졸론을 복강 내 투여하였을 때 110 dB SPL의 2 kHz 순음을 10분간 자극한 기니픽에서는 청력의 변화가 예방되었으나 115 dB 또는 120 dB SPL의 순음을 10분간 노출시켰을 때에는 예방효과가 없었다는 연구 결과를 볼 때¹⁾ 메틸프레드니졸론의 소음성 난청 예방 효과는 심하지 않은 소음에서만 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다. 본 연구에서는 마우스에게 120 dB의 백색잡음을 3시간 동안 자극하여 일과성 난청을 유발하였다. 그러므로 본 연구에서 얻어진 결과를 고려할 때 코티코스테론의 증가는 일과성 소음성 난청에 대해서는 예방효과를 가지는 것으로 확인할 수 있으나 영구성 소음성 난청에 대해서는 아직 단언할 수 없으며 향후 연구를 통해 밝혀야 할 것이다.

결 론

마우스에게 HPA 축 비활성기에 투여된 프레드니졸론은 체내의 코티코스테론 농도를 증가시켜 HPA 축을 활성화시키고 이는 일과성 소음성 난청을 예방하는 효과를 가지는 것으로 나타났다.

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