Tonotopic Expression of Fos Protein Following Pure Tone Stimulation in Rat Auditory Brainstem Nuclei

Park, Byung Hoon; Cha, Heung Eog; Lim, Hyun Ho

Original Article

Anatomy and physiology

Korean Journal of Audiology 1997;1(2):136-142.

Tonotopic Expression of Fos Protein Following Pure Tone Stimulation in Rat Auditory Brainstem Nuclei

Byung Hoon Park¹, Heung Eog Cha¹, Hyun Ho Lim²

¹Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, College of Medicine, Gachon University, Incheon
²Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea

흰쥐의 청각뇌간핵에서 순음자극의 주파수에 따른 Fos단백의 발현 양상

박병훈^¹^, 차흥억^¹^, 임현호^²

^¹가천대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
^²고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실

Abstract

Fos is a protein product of proto-oncogene c-fos which is induced by various kinds of stimulations such as noxious, physiologic and electrical stimulations. The expression of Fos, therefore, has been used as a potential cellular marker to identify functionally active neurons that were part of specific pathways in the central nervous system. This study utilized neuronal Fos expression to demonstrate the neuronal activity and to obtain the tonotopic mapping of the auditory brainstem nuclei in the rat. Adult male Sprague-Dawley rats were exposed to 90 dB SPL with a 4, 8 or 12 kHz continuous pure tone for 60 minutes and expression patterns of Fos in the auditory brainstem nuclei were detected by immunohistochemistry. Fos-like immunoreactivity was detected in only a small number of neurons in control animals. Howerever, in experimental group with acoustic stimulation markedly increased numbers of Fos-like immunoreactive neurons were observed in the dorsal cochlear nucleus and the central nucleus of inferior colliculus. In the inferior colliculus, Fos-like immunoreactive neurons formed isofrequency contours, shifting from medial to lateral with tones frequency increasing. Thus, Fos expression may produce a useful method of investigating neuroanatomical relationships and tonotopic mapping in the auditory brainstem nuclei following acoustic stimulation.

Keywords: Fos;Immunohistochemistry;Pure tone;Tonotopy;Auditory brainstem nuclei.

서론 골육종을 유발하는 전구암유전자인 c-fos의 단백질 산물인 Fos가 여러 종류의 생리적, 병리적 자극에 의하여 뇌의 신경핵과 척수의 신경에서 빠르고 일시적인 발현된다는 것이 밝혀진 이래 신경세포의 전달 경로를 연구하는데 많이 이용되어 왔다1-7). 청각중추의 신경전달 경로는 매우 복잡한 다단계 신경엽전달계(multi-synaptic pathway)를 이루고 있기 때문에8), 이를 규명하기 위해 2-deoxyglucose(2DG)를 이용한 자가방사선촬영법으로 소음자극에 대한 신경핵의 활성화에 대한 연구9-11)가 진행되어 왔으나 낮은 해상도로 인해 많은 제약이 있어 왔다. 소음 자극에 의한 간질발작(audiogenic seizure)의 유발12) 후 청각 신경핵에서 Fos 면역반응이 발현이 보고 된 후 Fos를 이용한 면역화학적염색 방법이 청각중추의 신경 전달 경로를 연구하는데 많이 이용되고 있다13-16). 본 연구는 Fos를 이용하여 4, 8 및 12 kHz의 연속된 순음자극 후에 청각뇌간핵에서 주파수에 따른 신경전달 체계를 관찰하고자 하였다. 실험재료 및 방법 실험재료 실험동물로는 정상 고막 및 정상 이개반응(Preyer reflex)을 보이는 체중 150~200 gm의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 사용하였고, 면역조직화학적염색에 이용된 일차항체는 sheep polyclonal anti-c-fos antibody(Cambridge Research Biochemistry, UK), 항원-항체 반응을 검색하기 위하여 Vectastain ABC kit(Vector Laboratories, Inc, USA)를 사용하였다. 방법 순음자극 및 검체의 처치 각각 일정한 주파수에 따른 순음자극을 인지하는 청각뇌간핵에서 신경전달로를 관찰하기 위하여 각 주파수에 대한 실험군은 3마리씩, 정상대조군은 순음자극없이 1마리를 사용하였다. 실험동물은 음자극전 30분간 방음된 곳에 보관한 후 양측에 스피커가 장치된 50×30×20 cm크기의 소음 피폭 상자에 넣고 순음발생기(Audio Generator, AG 202A, Trio-Kenwood Corp, Japan)를 이용하여 4, 8, 16 kHz의 연속된 순음을 90 dB SPL의 강도로 60분간 자극 하였다. 자극 순음의 강도는 소음 피폭 상자의 중앙에서 소음측정기(Sound level meter, SL-1350, Custom Corp, Japan)를 이용하여 측정하였다. 실험동물은 음 자극 후 30분 동안 희생 시킬 때 까지 방음된 곳에서 보관하였다. 자극을 종료한 다음 30분 경과 후 ketamine(30 mg/kg)을 복강내 주사하여 실험동물을 깊게 마취하고 개흉하여 심장을 노출시키고 좌심실 및 상행대동맥을 통하여 생리식염수를 관류하여 혈액성분을 완전히 제거한 다음 연속적으로 고정액(4% paraformaldehyde in 0.1 mol/L sodium phosphate buffer, pH 7.4)으로 관류 고정한 후 뇌조직을 채취하여 동용액에 4℃에서 12시간 침투고정하였다. 고정된 뇌조직은 vibratome을 이용하여 60μm의 두께로 연속 절편을 만들어 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline：PBS, pH 7.4)에 부양하였다. 정상대조군은 순음자극없이 위와 같은 방법으로 관류고정 후 뇌조직을 얻어 인산완충생리식염수에 부양하였다. 면역조직화학적 염색 조직절편들은 시험관에 부양된 상태에서 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 0.3% H2O2/PBS로 10분간 상온에서 처리하고, 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척 후 일차 및 이차항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위하여 정상 토끼혈청으로 40분간 실온에서 처리하였다. 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척 후 일차항체(sheep polyclonal anti-c-fos antibody：Cambridge Research Biochemistry)에 4℃에서 24시간 반응시켰다. 그다음 10분씩 3회 수세한 후 이차항체(rabbit biotin-labeled anti-sheep Ig G)에 실온에서 2시간 동안 반응시키고 다시 수세한 후 HRP(horseradish peroxidase-labeled strepavidine)용액에 반응시킨 다음 DAB(0.05% 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride/0.006% H2O2/0.05 mol/L PBS, pH 7.4：Sigma, USA)로 발색반응을 하였다. 발색반응이 끝난 절편들은 증류수로 세척한 다음 슬라이드에 붙여 탈수 및 봉입하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 순음에 노출시키지 않은 정상대조군은 위와같은 방법으로 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 결과 흰쥐의 뇌조직에서 c-fos항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 대조군에서는 Fos단백의 발현이 없었으며, 순음자극을 시행한 전체 실험군의 청각뇌간핵에서 Fos단백에 대한 양성반응성을 보였으며, 특히 와우핵(cochlear nucleus)과 하구(inferior colliculus)에서 강한 염색반응을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 와우핵에서 Fos단백의 발현 순음자극을 받은 흰쥐의 와우핵에서 Fos단백의 발현은 특히 후와우핵(dorsal cochlear nucleus)의 국소 부위에서 강한 양성반응을 보였으나 각 주파수별 자극순음에 따른 양성반응의 발현 위치가 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). 하구에서 Fos단백의 발현 순음자극을 받은 흰쥐에서 Fos단백의 발현은 하구에서 가장 강한 양성반응을 보였으며 이들의 발현은 자극순음의 주파수에 따라서 하구의 중심핵(central nucleus of inferior colliculus)에서 뚜렷한 띠(band)를 형성하였다. Fos단백의 발현은 4 kHz의 순음에서는 하구중심핵의 내측에서 띠를 형성하여 나타났으며, 12 kHz의 순음에서는 하구중심핵의 외측에서, 8 kHz의 순음에서는 4 kHz, 12 kHz 경우의 사이에서 띠를 형성하여 나타났다(Fig. 3). 고안 c-fos는 세포의 성장에 관여하는 인자로서 대부분의 세포에 낮은 농도로 존재하고 있으며2)17), 자극을 받은 말초신경에서 이차 정보전달체(second messengers)인 cAMP와 Ca2＋의 농도가 세포질 내에 증가하여 c-fos의 전사(transcription)가 유도됨으로서 이의 단백산물인 Fos가 세포 내에서 증가하게 된다2)18). Fos의 반감기는 10~15분 정도로 짧으므로 특정 자극에 대한 즉각적인 신경활성의 지표가 된다2)18). 따라서 Fos의 이러한 성질을 이용하여 본 실험에서 순음자극 후 Fos에 대한 항체를 사용한 면역조직화학적 검색으로 와우핵과 하구에서 Fos의 발현을 성공적으로 관찰할 수 있었다. 그동안 신경전달로의 해명을 위하여 많이 사용되어 왔던 방법들은 주로 말초신경자극에 대한 뇌의 국소적인 반응을 전기생리학적으로 검색하는 연구가 주종이였으며 이러한 실험은 미세기구를 이용하여 복잡한 신경섬유군에서 단일 신경의 반응을 측정함으로서 이루어졌다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 소모될 뿐만 아니라 마취로 인한 신경 반응이 저하되는 단점을 가지고 있다. 그 후 Ryan 등9)10)은 청각중추의 신경전달 경로를 규명하기 위해 2-deoxyglucose(2DG)를 이용한 자가방사선촬영법으로 소음자극에 대한 신경핵의 활성화에 대하여 보고하였으나 낮은 해상도로 인해 그 결과가 불명확하였다. 그 다음 소음 자극에 의한 간질발작(audiogenic seizure)의 유발 후 청각 신경핵에서도 Fos 면역반응이 발현된다는 것이 보고12) 된 후 여러 연구자들13-16)에 의해 Fos면역반응이 청각중추의 신경 전달 경로를 연구하는데 간단명료한 방법으로 제시되었다. 즉, Ehret와 Fisher13)는 신경의 전기적인 활동상태를 확인하는 방법의 하나인 2-DG를 이용한 자가방사선촬영과 Fos를 비교한 결과 2-DG에 의한 자가방사선촬영은 시냅스되는 부위에 강한 반응이 일어나 각각의 세포를 구별하기 어려운 단점이 있는 반면에, 면역조직화학적염색을 이용하여 Fos의 발현양상을 검색하는 것이 국소 해상력이 우수하기 때문에 청각중추 전달체계를 이해하는데 더 유용하다고 주장하였다. 더 나아가서 Sagar 등19)도 Fos를 이용한 면역조직화학적 검색방법이 전기적으로 활동상태의 신경을 확인하는 데 가장 빠른 방법이라고 제시하였다. 본 연구에서도 Fos의 발현이 자극을 받은 각각의 신경세포에서 나타나는 것을 면역화학적 방법으로 비교적 쉽게 관찰할 수 있었으므로 활동상태의 신경군을 관찰할수 있는 간편하고 빠른 방법이라고 생각된다. Dragunow20)는 전기생리학적으로 신경전달로를 연구하는데 이용하는 실험에서는 영향을 줄 수 있는 인자로 Ketamine이나 barbiturate계통의 약물이 반응을 억제시킬 수 있으며, 또한 자극을 주기 위해 사용한 전기침도 2주전에 미리 고정시킨 후 실험해야 한다고 하였으며 실험 전 비특이적인 Fos의 발현을 줄이기 위해 동물을 희생하기 전에 불필요한 자극을 피해야 한다고 주장하였다. 본 연구에서 실험동물을 희생시킬 때 Ketamine을 사용하였는데 이는 순음자극 후에 사용하였으므로 Fos발현에는 영향이 없었을 것으로 사료된다. Dragunow와 Robetson18)은 백서의 뇌를 이용한 연구에서 자극이 없는 상태에서는 대뇌피질(cerebral cortex), 해마(hippocampus), 선조체(striatum)와 대뇌 변연계(limbic system)에서 Fos에 대한 약한 면역반응을 보이나, 경련을 유발한 후에는 이상엽(piriform lobe), 대상회전(cingular gyrus)와 치상회(dentate gyrus)에 급격히 증가한다는 것을 보고함으로써 이는 c-fos가 신경계통의 성장에 관여할 것이라고 추정하였다. 그러나 Salle와 Naquet 12)는 유전적으로 경련이 쉽게 발생하는 DBA/2 mice에 청각성 발작(audiogenic seizure)를 유발시키면 Fos에 대한 면역반응이 대뇌 피질이 아닌 주로 대뇌피질하 청신경핵(subcortical auditory nuclei)인 상올리브 복합체(superior olivary complex), 하구와 내슬상체(medial geniculate body)에 표현된다고 하여 청각성 발작이 대뇌피질에 주로 작용을 주장한 Dragunow와 Robertson18)과는 다른 의견을 제시하였다. 저자의 실험에서는 비록 대뇌 피질부위는 관찰하지 않았지만 주로 음 자극 후 와우핵과 하구에서 Fos의 발현을 관찰할 수 있었다. Rouiller 등14)은 순음자극 후 주파수에 따른 Fos의 발현을 관찰하였는데, 주파수를 증가시킴에 따라 후와우핵에서는 전반부에서 후반부로, 하구에서는 후외방에서 전내방으로 Fos가 발현되어 주파수에 따른 특이한 반응을 보이고, 슬상체(geniculate body)에서는 내측과 후반부에서는 발현이 되나 전반부에서는 표현되지 않는다고 보고하였다. 또한 상올리브 복합체에서는 Fos양성반응이 나타나지 않아 Fos가 와우핵과 상올리브 복합체에서는 순음자극 후에 청각중추의 전달 체계를 나타내는 일반적인 세포학적 표식인자로 적절하지 않다고 주장하였다. 본 연구에서도 슬상체와 상올리브 복합체에서 Fos반응이 없어 추후 이에 대한 연구가 보완되어야 하며 상올리브 복합체에서도 전달도를 연구하는 데는 어렵다고 생각된다. 장 등 21)은 일측에 국한적으로 자극을 주어 와우핵이나 상올리브복합체에서는 자극을 준 편에 특징적으로 증가하나 하구에서는 자극을 준 반대편에 Fos의 발현이 증가하기 때문에 청각중추의 전달과정에서 하구 이전에서 신경의 교차가 일어남을 알 수 있다고 하였다. 본 실험에서는 후와우핵과 하구의 국소 부위에서 강한 양성반응을 확인할 수 있었으며, 특히 하구에서 와우핵보다 Fos면역반응이 더 강하게 나타나므로 이 결과 역시 하구 이전에서 신경의 교차가 일어난다는 것을 간접적으로 시사하는 소견이라 하겠다. 또한 후와우핵에서는 자극순음의 주파수에 따른 Fos의 발현부위는 변화가 없었으나, 하구의 중심핵(central nucleus of inferior colliculus, CIC)에서는 자극순음의 주파수에 따라서 뚜렷한 차이를 관찰할 수 있었는데 Rouiller 등14)의 결과와 다르게 Fos단백의 발현이 주파수를 증가시킴에 따라 내방에서 외방으로 관찰되어 추후 이에 대한 연구가 계속되어야 한다고 사료되었다. 결론 흰쥐에서 4, 8 및 16 kHz의 연속된 순음을 90 dB SPL의 강도로 60분간 자극 후 뇌조직에서 Fos항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 다음과 같은 성적을 얻었다. 1) 대조군에서는 Fos단백의 발현이 없었으며, 순음자극을 시행한 전체 실험군의 청각뇌간핵에서 Fos단백에 대한 염색반응성을 보였다. 2) 실험군에서는 와우핵과 하구에서 강한 염색반응을 관찰할 수 있었다. 3) 실험군의 와우핵에서 Fos단백의 발현은 특히 후와우핵에서 뚜렷하였으며, 국소적으로 띠를 형성하는 양상으로 관찰되었다. 4) 실험군에서 Fos단백의 발현은 하구에서 가장 강한 염색반응을 보였으며 이들의 발현은 자극순음의 주파수에 따라서 하구의 중심핵에서 뚜렷한 띠(band)를 형성하였다. 5) 실험군의 하구중심핵에서 Fos단백의 발현은 주파수를 증가시킴에 따라 내방에서 외방으로 이동되는 양상으로 관찰되었다. 결론적으로 흰쥐에서 각 주파수에 따른 여러 순음 자극 후의 Fos단백의 발현을 중추청각 경로에서 면역조직화학적방법으로 관찰함으로써 청각중추의 전반적이고 체계적인 신경전달 체계를 이해하고 난청연구를 비롯한 청각기관의 신경생물학 연구에 기초자료로 도움이 될 것으로 사료된다.
REFERENCES
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