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Inner Ear Diseases
Korean Journal of Audiology 1998;2(1):54-59.
Expression of Anti-Heat Shock Protein 70 and Anti-68kDa Protein in the Sera of the Patients with Sensorineural Hearing Loss
See-Ok Shin, Moo-Jin Choo, Wan-Kyo Jeong
Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chungbuk National University, Cheongju, Korea
감각신경성난청환자 혈청에서의 Anti-Heat Shock Protein 70과 Anti-68kDa Protein의 발현양상
신시옥, 추무진, 정완교
충북대학교 의과대학 이비인후과학교실
Abstract

The 68kDa antigen detected by the sera of patients with autoimmume inner ear disease is known to represent the highly inducible heat shock protein 70 (hsp70). After this, It is necessary to verify the results using the crude inner ear 68kDa antigen. Bovine kidney (MDBK) cells were cultured at 37℃ and some of them were heat shocked at 42.5℃. Proteins in normal and heat shocked cells were separated using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Patient serum was reacted simultaneously with the blots of non-heat shocked cells and heat shocked cells. The serum was considered positive if the band in the 70kDa location was denser in the lane with heat shocked cells relative to non-heat shocked cells. Blots of bovine inner ear extracts were prepared and the sera were reacted with bovine inner ear antigen. Presence of the antibody against the 68kDa protein was compared with the result of immunoblotting with MDBK cells. Of the positive sera against 68kDa antigen, 36% were negative against hsp70, and of the positive sera against hsp70, 36% were negative against 68kDa antigen. These differences appeared to result from the greater sensitivity of the differential anti-hsp assay and from difficulties in interpreting the results in blots with bovine inner ear extracts because of faint, broad or overlapping multiple bands. The test for this antibody should be aimed to detect the hsp70 itself and the differential assay, using cultured and heat shocked MDBK cells, was thought to be a more reliable method. 

Keywords: 68kDa protein;Heat shock protein 70;Sensorineural hearing loss.
서론 1990년 Harris와 Sharp1)는 소 내이 추출물을 이용한 western blot 상에서 68kDa 단백질 항원을 발견하였다. 그들은 급속진행형 감각신경성 난청환자들의 35%가 혈청에서 이 68kDa 단백질에 대한 항체를 가지고 있는데 비하여 정상인에서는 7%만이 이 항체를 가지고 있다고 발표하였다. 또한 이 단백질에 양성을 보이는 환자들에게서 스테로이드 치료에 반응함을 보고하였다. 이후 연구에서 내이 특이 항원들이나 기관 비특이 항원들(organ-nonspecific antigens)에 대한 여러 항체들이 발표되었으나 항68kDa 항체만이 급속진행형 감각신경성 난청환자의 혈청에서 유의하게 발현된다고 보고되었다.2) 최근 Billings3) 등은 이 68kDa 단백질이 inducible heat shock protein 70(hsp70)이라고 발표하였으며 Shin4) 등은 메니어병 환자의 33%에서 항hsp70 항체가 혈청에서 발견된다고 하였다. 68kDa 항원이 inducible hsp70으로 밝혀짐에 따라 지금까지 내이 질환과 관련하여 소 이에서 추출된 조야한 68kDa 항원의 이름으로 발표되었던 많은 결과들의 재검정이 필요하게 되었으며 또한 앞으로는 환자의 혈청에서 hsp70에 대한 항체를 검사함으로서 더욱 정확하고 예민한 결과를 기대할 수 있게 되었다. 저자들은 내이질환 환자의 혈청에서 항68kDa 항체과 항hsp70 항체의 발현양상을 비교하고 또한 항hsp70을 검출할 수 있는 보다 신뢰성있는 방법을 시험하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 연구대상 및 방법 실험 대상 내이질환을 주소로 항68kDa 단백질에 관한 항체 검사가 의뢰되었던 150례를 대상으로 하였으며, 이 중 57례가 남자, 93례가 여자이었고 평균연령은 43.2세였다. 소 내이에서의 항원 추출 영하 20도로 보관된 소 내이에서 와우 및 전정 조직을 추출하여 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)와 1 ug/ml aprotinin이 포함된 50 mM Tris-HCl(pH6.8) 완충용액에서 균질화시키고 이를 20,000 g에서 10분간 원심분리하였다. 이 pellet을 0.5% sodium dodecyl sulfate(SDS), 0.2 mM EDTA 및 0.2 mM PMSF가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH6.8) 완충용액에서 30분 반응시킨 후 10분간 1,000g에서 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 용액의 단백질농도를 bicinchoninic acid법(Pierce, Rockford, IL, USA)으로 측정하고 ethanol침전을 이용하여 electrophoresis sample buffer(62.5 mM Tris-HCl, 5% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 2.3% SDS, 0.001% bromophenol blue)에 단백질농도가 4mg/ml가 되게 용해시켜 5분간 끓였다. 배양된 소 신장세포에서의 항원 추출 소 신장세포주인 MDBK(NBL-1) 세포를 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 37℃에서 10% 송아지혈청이 포함된 minimal essential medium(Eagle’s)에서 배양하였다. 배양된 세포들을 pH 7.4의 Tris buffered saline(TBS)로 세척한 후 긁게를 이용하여 100 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF 및 1 ug/ml aprotinin이 포함된 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)에서 수확하였다. 배양세포 중 일부는 42.5℃에서 3시간 열 쇼크를 주고 5시간 동안 37.5℃에서 회복시간을 준 후 같은 방법으로 수확하였다. 수확된 세포들을 sonication(50 Sonic Dismembrator;Fisher Scientific)하고 단백질농도를 측정한후 ethanol 침전법을 이용하여 단백질농도가 2mg/ml 되게 electrophoresis sample buffer에 용해시켜 5분간 끓였다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis) 및 Immunoblotting SDS-PAGE는 Laemmli5)의 방법을 이용하였으며 Mini Protean II cell(Bio-Rad)에서 10% separating gel(pH 8.8)과 4.5% stacking gel(pH 6.8)을 사용하였다. 소 내이에서 추출된 항원용액과 MDBK cell에서 추출된 항원용액은 각각 다른 gel상에서 전기영동하였다. 열처리한 MDBK cell에서 추출한 항원용액과 열처리하지 않은 MDBK cell에서 추출한 항원용액은 같은 gel상에서 번갈아가며 다른 lane에서 전기영동하였다. 각 lane에는 7 ul의 항원용액을 부과하였다. 전기영동 후 20% methanol이 포함된 Laemmli의 Tris-glycine 완충액상에서 단백질들은 nitrocellulose membrane에 전이시켰다. 이를 0.25% Ponceau S로 염색하여 단백질들이 성공적으로 전기영동되었는지 확인하였다(Fig. 1). Immunoblotting을 위하여 membrane을 lane 별로 잘라서 0.25% polyoxyethylenesorbitan(Tween-20)이 포함된 5% 가루우유용액에 30분간 포화시켰다. 이들을 1% 가루우유와 0.1% Tween-20이 포함된 TBS를 이용하여 1:400으로 희석시킨 환자의 혈청과 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이들을 TBS/0.1% Tween-20으로 세척한 후 peroxidase-labeled goat anti-human IgG를 1:1000으로 희석시켜 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 세척 후 0.01% hydrogen peroxide가 포함된 0.2M NaCl이 첨가된 50mM Tris-HCl(pH 7.4)에서 0.67 mg/ml 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)와 발색반응 시킨 후 탈이온수로 반응을 중지시켰다. 결과 MDBK cell에서 추출한 단백질과의 반응에서는 한 혈청당 열처리한 세포 lane과 열처리하지 않은 세포 lane에 각각 반응시켜 이 두 lane을 비교하여 70kDa의 동일위치에서 열처리 세포 lane에서 더욱 진한 band가 관찰될 경우 이 혈청은 항hsp70 항체를 가진 것으로 판단하였다. Fig. 2는 양성혈청의 예로 열처리 lane들에서 70kDa 영역에서 비열처리 lane들에 비하여 진하게 발현되는 band를 볼 수 있다. 즉 이 두 band를 비교 관찰함으로서 항hsp70 항체 양성 여부를 쉽게 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다. Fig. 3은 소 내이 조직 항원을 이용한 gel에서 68 kDa 부근에서 band를 보이는 혈청들을 모아본 것으로 항68kDa 항체 양성 혈청(b)에 비하여 약간의 분자량 차이를 보이거나 미약한 반응, 넓은 band 또는 다중의 band들이 나타나거나 하는 경우 항68kDa 항체 양성여부를 판단하기 어려움이 있었다. 실험군 150례에서 항68kDa 항체 양성여부와 항hsp 70 항체 양성여부를 비교한 결과는 Table 1과 같았다. 68kDa단백질에 항체를 가진 것으로 판독된 혈청은 25례이며 이들 중 16례는 hsp70에도 항체 양성으로 나타났으나 9례(36%)는 hsp70에 대한 항체 음성으로 나타났다. 또 항hsp70 항체 양성을 보인 혈청은 25례이었으며 이들 중 16례는 항68kDa단백질 양성이었으나 9례(36%)는 음성으로 나타났다. 고찰 Harris와 Sharp1)는 급속진행형 감각신경성난청 환자의 혈청에서 68kDa단백질에 대한 항체를 발견했는데 그들은 항원으로 소 내이조직을 사용하였고 Western blot을 이용하여 이 항체를 검출하였다. 이후 여러 연구들에서 같은 방법으로 준비된 항원을 이용하여 급속진행형 감각신경성 난청 환자나 메니어씨병 환자의 혈청에서 대조군에 비하여 의미있게 증가된 빈도로 항68kDa 항체가 발현됨을 보고하였다.2)3) Moscicki6) 등은 항68kDa단백질 항체를 지닌 환자군에서 면역억제치료에 잘 반응함을 보고하였다. 현재 68kDa 단백질에 관한 항체검사는 임상적으로 유용함이 입증되고 있으나 이 항원을 준비함은 어렵고 많은 시간을 요구하는 작업이다. 소 내이조직은 두꺼운 측두골 속에 있어 이를 적출함은 고도의 수술기법을 필요로 하며, 보다 작은 실험실 동물군에서도 이 단백질을 얻을 수 있으나 다량의 혈청을 대상으로 검사할 만큼 충분한 양의 항원을 얻기가 힘든 실정이다. 이러한 문제점들은 68kDa 항원이 도처에 편재(ubiquitous)하여 나타난다는 Yamanobe와 Harris2)의 관찰을 이용하면 보다 다량의 조직을 쉽게 얻을 수 있는 뇌나 신장을 이용하면 어느정도 해결 가능하다. 그러나 68kDa 단백질을 이용한 항체검사의 보다 큰 문제점은 이러한 조직에서 추출한 단백질들 중 68kDa 단백질의 양이 일정함을 확인할 수 없다는 점, 즉 항원농도의 표준화가 불가능하다는 점과 또한 인체혈청과 반응시킬 경우 68kDa 단백질 뿐 아니라 조직에 포함된 다양한 단백질들에 대하여 항원항체반응을 일으킬 수 있다는 점이다. 그 대표적인 것이 소의 혈청 알부민인데 이것은 68kDa 단백질과 거의 유사한 전기영동 분자량을 보이며 소의 조직 추출물에 상당한 양이 오염되어 들어 있을 수 있다. 따라서 환자가 이에 대한 항체를 보유하고 있을 경우 68kDa 단백질 양성으로 오인될 수 있을 가능성이 있다. 이러한 혈청 알부민 뿐아니라 비슷한 전기영동 분자량을 가지는 많은 단백질들이 존재할 것이므로 항상 이들에 의한 위양성 반응의 가능성은 상존하고 있다. 따라서 종래의 68kDa 단백질을 이용한 검사에서는 항상 양성대조 혈청을 인접 lane에 함께 반응시켜 이와 비교하여 양성여부를 판단하여 왔다. 그럼에도 불구하고 어떤 혈청들에서는 매우 미약하거나 넓거나 또는 다중의 band 등을 나타냄으로서 판독이 어려운 경우들이 있었다. Billings3) 등과 이후 Bloch7) 등은 68kDa 단백질이 inducible hsp70이라고 발표하였다. 이 hsp는 정상세포에서 단백질생성 및 성숙에 관여하는 molecular chaperone으로 특히 inducible form의 hsp는 다양한 형태의 스트레스에 세포가 노출되었을 때 유도생성되어 세포를 보존하는 역할을 하고 있다. 중이나 내이에서도 열, 저산소증, 소음 또는 세균 등에 노출된 후 hsp70이 생성된다는 것이 동물실험에서 밝혀진 바있다.8-12) 급속진행형 감각신경성난청이나 메니어병 환자들의 혈청에서 이 단백질에 대한 항체가 발견되는 원인은 아직 밝혀지고 있지 않다. 이 질환들이 내이조직에서 과량 생성된 hsp70에 대한 면역반응의 결과인지 또는 단순히 질환의 진행과 더불어 나타나는 현상인지는 더 연구가 필요한 실정이다. 68kDa 단백질이 이러한 inducible hsp70 밝혀진 후 상기한 여러 문제점을 지닌 68kDa 단백질로 실험한 결과들에 대한 재검정이 필요하게 되었다. 본 연구에서는 실험 항원으로서의 68kDa 단백질의 여러 문제점들을 극복하기 위하여 hsp70의 가장 뚜렷한 특징, 즉 스트레스 상태에서 hsp70이 과량 발현된다는 성질을 이용, 항원인 inducible hsp70를 생성하여 이를 전기영동하고 환자의 혈청과 반응시켜 항체 양성여부를 판독할 수 있는 방법을 사용하였다. 즉 MDBK 세포를 배양하여 열 쇼크를 줌으로서 inducible hsp70를 생성시킨 세포추출물과 열 쇼크를 주지않은 세포추출물을 인접 lane에 전기영동하여 동일 혈청과 반응시킴으로서 이 혈청이 항hsp70 항체를 지니고 있을 경우 70kDa 영역에서 뚜렸한 density의 차이를 보이는 band를 관찰하여 쉽게 양성임을 판독할 수 있었다. 아울러 이러한 방법을 이용함으로서 항원농도의 표준화의 필요성을 줄일 수 있었을 뿐아니라 양성대조혈청에 대한 의존도를 줄일 수 있었다. 또한 저자들은 150명의 내이질환 환자에서 종래의 방법으로 소 내이항원을 얻어 전기영동한 후 환자의 혈청과 면역반응시키고 항68kDa 단백질 항체 양성 유무의 결과와 MDBK 세포주를 이용한 항hsp70 항체 유무의 결과를 비교하였는데 68kDa단백질에 항체를 가진 것으로 판독된 혈청 중 36%에서 hsp70에 대한 항체 음성으로 나타났으며 또 항hsp70 항체 양성을 보인 혈청 중 36%에서 항68kDa단백질 음성으로 나타났다. 즉 MDBK 세포주를 이용한 hsp70에 대한 항체 검사에 비하여 소 내이항원을 이용한 항체검사의 경우 36%의 위양성률 및 36%의 위음성률을 보인다고 할 수 있다. 이러한 차이가 68kDa 단백질이 hsp70이라는 사실에 대해 의심을 주는 것은 아니며 열처리 및 비열처리 MDBK 세포를 이용한 항hsp70 항체검사의 민감도와 특이도가 높고 또한 소 내이항원을 이용한 검사의 상기한 여러 문제점 때문으로 판단된다. 따라서 지금까지 항68kDa 항체의 이름으로 발표되었던 여러 질환들에서의 양성반응률 또한 이러한 오차를 염두에 두고 해석되어야 할 것으로 사료된다. 또한 앞으로 내이질환 환자의 혈청에서 이 항체의 양성유무를 검사할 경우 종래의 소 내이항원을 이용한 항68kDa 단백질에 대한 항체검사법이 아닌 hsp70에 대한 항체를 검사하는 목적으로 시행되어져야 하며 이러한 목적으로 세포 배양 후 정상세포와 열처리한 세포를 항원의 재료로 이용하여 western blot 후 70kDa 영역에서 나타나는 band를 비교 분석하는 분별검사법이 그 한 유용한 방법으로 사료된다. 결론 내이질환환자 150례의 혈청에서 소 내이 항원에서 추출한 68kDa 단백질에 대한 항체와 MDBK 세포주에서 추출한 hsp70에 대한 항체 유무를 관찰 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1) 68kDa단백질에 항체를 가진 것으로 판독된 혈청 중 36%에서 hsp70에 대한 항체 음성으로 나타났으며 또 항hsp70 항체 양성을 보인 혈청 중 36%에서 항68kDa단백질 음성으로 나타났다. 2) 양 항원에 대한 항체 발현률의 차이는 MDBK 세포주를 이용한 항hsp70에 대한 분별검사법의 민감도 및 특이도가 높고, 소 내이 항원을 이용한 항68kDa 검사시 나타나는 band 판독의 어려움에 기인하는 것으로 사료된다. 3) 종래 소 내이 68kDa 항원을 이용하여 검사되었던 항hsp70 항체검사는 hsp70 자체를 항원으로 검사되어야 하며 이를 위해 배양세포주를 이용한 항hsp70 분별검사법이 그 한 유용한 방법이 될 수 있다.
REFERENCES
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